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1、ICS11.220R41中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T683-2003犬傳染性肝炎診斷技術(shù)Diagnostictechniquesforinfectiouscaninehepatitis2003-07-30發(fā)布2003-10-01實(shí)施中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布NY/T683-2003月U舌本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出并歸口本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:田克恭、王宏偉、遇秀玲、陳西釗、王傳彬、楊秀勇。NY/T683-2003犬傳染性肝炎診斷技術(shù)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了
2、犬傳染性肝炎(ICH)的臨床診斷、犬傳染性肝炎病毒(ICHV)的分離與鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫酶組織化學(xué)方法等診斷技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于犬傳染性肝炎的診斷。2臨床診斷要點(diǎn)2.1臨床癥狀最急性病例，患犬在嘔吐、腹痛和腹瀉等癥狀出現(xiàn)后數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。急性型病例，患犬體溫呈馬鞍型升高，精神抑郁，食欲廢絕，渴欲增加，嘔吐，腹瀉，糞中帶血。亞急性病例，特征性癥狀是患犬角膜一過性混濁，即“藍(lán)眼”病，有的出現(xiàn)潰瘍。慢性病例多發(fā)于老疫區(qū)或疫病流行后期，患犬多不死亡，可以2,i.:2t病理變化病犬主要表現(xiàn)全身性敗血癥變化。在實(shí)質(zhì)器
3、官、漿膜、粘膜上可見大小、數(shù)量不等的出血斑點(diǎn)。肝腫大，呈斑駁狀，表面有纖維素附著。膽囊壁水腫增厚，灰白色，半透明，膽囊漿膜被覆纖維素性滲出物，膽囊的變化具有一定的診斷意義。3病毒分離與鑒定3.1材料準(zhǔn)備3.1.1試荊3.1.1.1改良最低要素營養(yǎng)液(DMEM)培養(yǎng)基，配方見第A.I章3.1.1.2犬腎傳代細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)。3.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)陽性血清:ICHV單克隆抗體，中和抗體效價(jià)1，1024.3.1.1.4標(biāo)準(zhǔn)陰性血清:無ICHV感染的犬血清。3.1.1.5新生牛血清，青霉素，鏈霉素3.1.2器材a)細(xì)胞
4、培養(yǎng)瓶;b)吸管;c)二氧化碳培養(yǎng)箱;d)37℃恒溫水浴箱;c)普通冰箱及低溫冰箱;f)離心機(jī)及離心管;9)研磨器械;h)普通光學(xué)顯微鏡;;)微量加樣器，容量5VL-50p1-50pL-200PL;j)0.45pm微孔濾膜。3.1.3樣品ICHV存在于病犬扁桃體、肝臟、脾臟等組織器官中。無菌采集這些器官用無血清DMEM制成20N組織懸液.3000r/min離心30min。取上清10000r/min離心20min，取上清用于ICHV分離。NY/T683-20033.2操作方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)用含8%新生牛血清的
5、DMEM培養(yǎng)基，在37'C一培養(yǎng)MDCK細(xì)胞。每3d-4d傳代一次，細(xì)胞長成單層時(shí)，用于ICHV分離。3.2.2病料接種將。.1m1處理好的組織懸液接種MDCK細(xì)胞，37℃吸附Ih，加人無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)3d-sd，觀察結(jié)果3.2.3結(jié)果觀察ICHV感染MDCK細(xì)胞3d-5d表現(xiàn)為細(xì)胞增大變圓、變亮、折光性增強(qiáng)、聚集成葡萄串狀。若第一次接種未出現(xiàn)細(xì)胞病變，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代。如仍無細(xì)胞病變，則判為ICHV檢測陰性。3.2.4ICHV的鑒定將出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物，用1%人“()’，型紅細(xì)胞進(jìn)行血
6、凝試驗(yàn)，血凝試驗(yàn)陽性者，再用ICHV單克隆抗體進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，鑒定毒株。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)4.1材料準(zhǔn)備4門.1試劑4.1.1.1EI1SA抗原包被板。4.1.1.2標(biāo)準(zhǔn)陽性血清:用ICHV抗原免疫犬獲得的血清。4.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)陰性血清:無工CHV感染的犬血清4.1.1.4酶結(jié)合物:辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗犬1以;。4.1.1.5磷酸鹽緩沖液(PBS):配制見第A.2章。4.1.1.6洗滌液:配制見第A.3章4.1.1.7樣品稀釋液:配制見第A.4章4.1.1.8底物溶液:配制見第A.6章.4.1.1
7、.9終止液:配制見第A.7章4.1.2器材a)酶聯(lián)檢測儀;1))微量加樣器，容量50川-200v工;。)370C恒溫培養(yǎng)箱4.1.3樣品采集被檢犬血液，分離血清。血清應(yīng)新鮮、透明、不溶血、無污染，密裝于滅菌小瓶內(nèi)，4℃或一300C保存或立即送檢。試驗(yàn)前將被檢血清統(tǒng)一編號(hào)，并用樣品稀釋液作1:160倍稀釋。4.2操作方法4.2.1試驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各兩孔和空白對(duì)照一孔。4.2.2在微孔反應(yīng)板孔中加入1‘160稀釋的待檢血清、陰性對(duì)照血清、陽性對(duì)照血清各100川，充分混勻后，置37℃作用20min,4.2.3
8、棄去各孔中液體、甩干。每孔加滿洗滌液漂洗三次，每次2min，甩干4.2.4每孔加人酶結(jié)合物100/1，置370C作用20min,4.2.5重復(fù)4.2.34.2.6每孔加人底物液100pL，置37'C避光顯色10min,4.2.7每孔加人終止液50川，置酶聯(lián)檢測儀于450nm波長測定各孔吸光度(OD)值。NY/T683-20034.3結(jié)果判定4.3.1陽性對(duì)照血清OD值)0.8;陰性對(duì)照
