熒光定量pcr 法原理匯總

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1、我們前面比較詳細(xì)地介紹了熒光染料法做定量PCR的有關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品，顯然，作為定量PCR的初期階段的熒光染料法還是有局限性的，比如，由于染料不能區(qū)分特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體等非特異產(chǎn)物，也不能區(qū)分不同探針，所以檢測的特異性始終不如后來出現(xiàn)的探針法；需要在PCR后進(jìn)行熔鏈曲線分析；也不能做多重PCR檢測（Multiplex）。上個世紀(jì)90年代原美國PerkinElmer(PE)公司開發(fā)出了Taqman熒光探針定量技術(shù)，將定量PCR帶入了更廣闊的應(yīng)用空間。Taqman探針法的出現(xiàn)是定量PCR技術(shù)的重

2、要里程碑，之后在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了雜交探針法，以及熒光引物法，是對探針法的不斷改進(jìn)和簡化。如果希望全面掌握定量PCR技術(shù)的研究人員就不能錯過這些定量檢測技術(shù)。要提到熒光探針或者熒光引物，有一個基礎(chǔ)概念需要首先明確，那就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)：一對合適的熒光物質(zhì)可以構(gòu)成一個能量供體(donor)和能量受體(acceptor)對,其中供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊，當(dāng)它們在空間上相互接近到一定距離(1—10nm)時，激

3、發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光能量正好被附近的受體吸收，使得供體發(fā)射的熒光強(qiáng)度衰減，受體熒光分子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。能量傳遞的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等有關(guān)。定量PCR所涉及的熒光探針和熒光引物的檢測都這個FRET原理相關(guān)。實時熒光PCR中另一個很重要的概念，即Ct值.C代表循環(huán)(Cycle)，T代表閾值(Threshold).Ct值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù).。一般取PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為

4、熒光本底信號，熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線.因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。一：水解探針法TaqMan技術(shù)原理：除了一對特異性引物，TaqMan探針法增加一條和模版互補的基因特異性探針（通常20—30bp），探針上5'端和3'端分別標(biāo)記了一個報告熒光基團(tuán)（供體）和一個淬滅熒光基團(tuán)（受體）

5、，在反應(yīng)初始（探針完整）時系統(tǒng)激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光信號被臨近的淬滅基團(tuán)吸收，所以此時檢測不到供體熒光信號；而當(dāng)PCR過程中TaqDNA聚合酶擴(kuò)增到探針結(jié)合模版的位點時，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探針5'端的報告基團(tuán)——游離的報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，打破能量的傳遞，激發(fā)報告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號就可以被熒光檢測系統(tǒng)檢測到。這樣每擴(kuò)增一條DNA鏈，就對應(yīng)有一個游離的熒光分子（報告基團(tuán)）形成，保證了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，因此對熒光信號進(jìn)行檢測就可以實時監(jiān)控PCR的

6、過程，準(zhǔn)確定量PCR的起始拷貝數(shù)。但是實際上探針較長使得兩端基團(tuán)距離較遠(yuǎn)，會導(dǎo)致熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團(tuán)也會產(chǎn)生不同波長的熒光，都會使得本底偏高.MGB技術(shù)原理：針對Taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，2000年美國ABI公司推出了一種新TaqMan探針——MGB探針（minorgroovebinderoligodeoxynucleotideconjugate,MGB-ODN)，3'端采用了非熒光性的淬滅基因——淬滅基團(tuán)吸收報告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。此外，MGB探

7、針的3'端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide,DPI3)，可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交,升高探針Tm值,使較短的探針同樣能達(dá)到較高的Tm值——而短探針的熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近,淬滅效果更好，熒光背景更低，使得信噪比更高：一個15bp的MGB探針的信噪比大于6,優(yōu)于理想狀態(tài)下的25bp的普通Taqman探針（信噪比約為1.5）。允許采用更短的探針也簡化了探針的設(shè)計和成本。有實驗證明MGB探針對于等位基因的區(qū)分比較理想，甚至

8、可以檢測單堿基突變(因為堿基錯配對較短探針的雜交穩(wěn)定性影響更大)水解探針之所以稱之為水解，主要是因為它利用的是Taq酶的水解作用，使得探針上的熒光報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)而發(fā)光信號，游離的報告基團(tuán)數(shù)目對應(yīng)PCR新擴(kuò)增產(chǎn)物，此方法檢測的是積累熒光。優(yōu)點：靈敏，特異性高：具有模版序列特異的Taqman探針在引物特異的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高的定量PCR的專一性；每擴(kuò)增一個特異產(chǎn)物只釋放一個分子的熒光染料，儀器檢測的是特異擴(kuò)增的結(jié)果，非特異產(chǎn)物對檢測信號沒有影響，有效提高檢測的專一性。有多種不同波長的熒光基團(tuán)對可