微生物常規(guī)鑒定技術(shù)

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1、微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一.形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察1.微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結(jié)構(gòu)（包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達到區(qū)別、鑒定微生物的目的。2.細菌細胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。，以此可以對不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗鑒別中

2、的一項重要內(nèi)容。2.1細菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運動、擴散情況?！?.2霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細菌的很相似，只是比細菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細菌相似，有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢

3、子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。18二、生理生化試驗微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物檢驗中常用的生化反應(yīng)有：1、尿素酶（Urease）試驗有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因為不論底物尿素是否存在，細菌均能合成

4、此酶。其活性最適pH為7.0。試驗方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均，于36±1℃18培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果?；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽性。2.氧化酶（Oxidase）試驗氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素C氧化，然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。試驗方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽性

5、者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色，Ewing氏改進試劑呈藍色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗結(jié)果。注意事項：鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液容易氧化，溶液應(yīng)裝在棕色瓶中，并在冰箱內(nèi)保存，如溶液變?yōu)榧t褐色，即不宜使用。鐵、鎳鉻絲等金屬可催化二甲基對苯撐二胺呈紅色反應(yīng)，若用它來挑取菌苔，會出現(xiàn)假陽性，故必須用白金絲或玻璃棒（或牙簽）來挑取菌苔。在濾紙上滴加試劑，以剛剛打濕濾紙為宜，如濾紙過濕，會防礙空氣與菌苔接觸，從而延長了反應(yīng)時間，造成假陰性。3.過氧化氫酶的測定過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解水和氧。試劑：3－10％過氧化氫（H

6、2O2）菌種培養(yǎng)：將測試菌種接種于合適的培養(yǎng)基斜面上，適溫培養(yǎng)18－24h。試驗方法：取一干凈的載波片，在上面滴1滴3－10％的H2O2，挑取1環(huán)培養(yǎng)18－24h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)，則為過氧化氫酶陽性，無氣泡者為陰性。也可將過氧化氫溶液直接加入斜面上，觀察氣泡的產(chǎn)生。注意事項：過氧化氫酶是1種以正鐵血紅素作為輔基的酶，所以測試菌所生長的培養(yǎng)基不可含有血紅素或紅血球。4、甲基紅（MethylRed）試驗?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥

7、珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。試驗方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于MR－VP生化鑒定管，于36通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36±1°C或30°C（以30°18C較好）3~5天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。甲基紅為酸性指示劑，pH范圍為4.4~6.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而增強黃色，在pH5.0以上，則隨堿度而增強黃色，在pH5.0或上下接近時，可能

8、變色不夠明顯，此時應(yīng)延長培養(yǎng)時間，重復(fù)試驗。5.V-P試驗?zāi)承┘毦谄咸烟堑鞍纂怂囵B(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化