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《豌豆凝集素基因的克隆與轉(zhuǎn)化煙草的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、豌豆凝集素基因的克隆與轉(zhuǎn)化煙草的研究周小全，張興國＊（西南大學園藝園林學院蔬菜實驗室重慶400716）摘要：豆科植物凝集素在植物對其相應的根瘤菌識別中起重要作用。設(shè)計特異引物擴增出豌豆(PisumsativumL.)凝集素基因(psl)，并亞克隆到植物表達載體pVCT2020中，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌EHA105介導,采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草（NicotianatobacumL.）。通過PCR分析鑒定Kan陽性植株。鑒定過程中排除了農(nóng)桿菌DNA干擾造成PCR假陽性的可能，證明psl基因已經(jīng)整合到煙草基因組中。該轉(zhuǎn)基因煙草可進一步用于與豌豆根瘤菌的相互作用分析。關(guān)鍵詞：豌
2、豆凝集素；DNA克隆；轉(zhuǎn)化；煙草；PCR；鑒定CloningofPeaLectinGeneandItsTransformationintoTobaccoZhouXiao-Quan，ZhangXing-Guo＊（CollegeofHorticultureandlandscapeArchitecture,SouthwestUniversityChongqing400716China）Abstract:Theleguminouslectinsplayanimportantroleinrecognitionofhostplantstotheirownrhizob
3、ia.ThepealectingenewasamplifiedbyPCR,usingspeciallydesignedprimers.ItwasthensubclonedintoplantexpressionvectorPcvt2020.Tobaccowastransformedbyco-cultivatingleafdiscviaAgrobacteriummediation.TheregeneratedKanamycin-resistanttransformantswereanalyzedbyPCR,eliminatinginterferencefro
4、mtheAgrobacteriumDNA.TheseresultsindicatedthepealectingeneintegratedintothetobaccogenomicDNA.ThistransgenicplantscouldbeusedinresearchesontheinteractionwithRhizobia.Keywords:pea；lectin；DNAcloning；transformation；tobacc；PCR；identification氮素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一直發(fā)揮著重要作用，全球每年可供利用的還原態(tài)氮中約有60％來自生物固氮，
5、其中豆科植物固氮量占82%[1]。提高生物固氮的量不僅可以降低能源消耗還可以減少環(huán)境污染。人們試圖通過分子生物學手段打破根瘤菌的宿主專一性障礙，從而擴大共生固氮的范圍。Hamblin等1973年首次報道了根瘤菌與凝集素的相互作用，他們提出假說：與菜豆凝集素相結(jié)合的根瘤菌到達菜豆的根部，在適當?shù)奈稽c感染植物[2]。Boblool等1974年指出凝集素在宿主植物專一性識別根瘤菌的過程中起著特殊作用，豆科植物凝集素在豆科植物根表面與適當?shù)母鼍砻娴奶禺愋远嗵钱a(chǎn)生特異性的相互作用[3]。Dazzo等1985年提出：三葉草根瘤菌吸附到三葉草根表面時,以其凝集素作
6、為中介，使三葉草根瘤菌選擇性地在三葉草根毛上積累[4]。Díaz等1989年報道：在豆科植物和根瘤菌共生作用中，宿主植物的凝集素起決定作用[5]；他在1995年用轉(zhuǎn)豌豆凝集素基因（psl）的三葉草接種豌豆根瘤菌，獲得結(jié)瘤固氮功能[5]。這些研究成果說明，凝集素基因的轉(zhuǎn)化可以擴大根瘤菌的宿主范圍。在非豆科植物轉(zhuǎn)化方面，EdwardsGA等1991年將psl轉(zhuǎn)入了馬鈴薯，但是未進行進一步的結(jié)瘤固氮方面的研究。張靜嫻、荊玉祥等利用CaMV35S啟動子將psl轉(zhuǎn)化到煙草與水稻中，并獲得了表達[7、8]。本研究是在克隆了包含啟動子和終止序列的psl的基礎(chǔ)上，進一步
7、把該基因?qū)霟煵葜?，從而為深入研究轉(zhuǎn)psl的非豆科植物與根瘤菌相互作用奠定了基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1植物材料豌豆(PisumsativumL.)種子為重慶地區(qū)市售的食用豌豆，煙草(NicotianatobacumL.cv.Wisconsin38)為本實驗室提供。1.2菌株與質(zhì)?！ 〈竽c桿菌(XL1-blue)和農(nóng)桿菌(EHA105)，植物表達載體pVCT2020(9.53kb)均由本實驗室保存和提供；pMD18-T(2.7kb)質(zhì)粒載體購自Takala公司。1.3PCR引物及擴增條件PCR目的產(chǎn)物基因為包含啟動子和終止序列的psl基因，設(shè)計上游引物P1
8、序列為GTTAAGTTCTGATGATGTGGTGTG，下游引物P2序列為CTA
