全基因組掃描定位易感基因的策略和方法

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1、全基因組掃描定位易感基因的策略和方法【關(guān)鍵詞】全基因組掃描定位易感基因基因在決定個(gè)體表型方面起著決定性作用,通過賦予個(gè)體對疾病的易感性或抵抗力,以及影響機(jī)體與環(huán)境因素的相互作用,基因?qū)膊〉陌l(fā)生起著間接或直接作用。因此,人們希望通過識別疾病相關(guān)基因,以最終實(shí)現(xiàn)疾病的基因診斷和基因防治[1]?！　∫蚪^大多數(shù)疾病是多個(gè)微效基因協(xié)同作用并與環(huán)境因素共同導(dǎo)致,此類基因賦予患者易感性,故稱為疾病易感基因(susceptibilitygenes)。隨著分子遺傳學(xué)和人類基因組計(jì)劃的發(fā)展和實(shí)施，分析復(fù)雜疾病的遺傳因素，定位疾病易感基因成為可能，

2、從而為疾病的早期診斷和預(yù)警帶來了希望[2]。迄今為止，對符合孟德爾規(guī)律的單基因病已經(jīng)建立了一套行之有效的研究體系并定位克隆了近千個(gè)致病基因。但對于多基因病，因其不完全符合孟德爾規(guī)律，所以在其易感基因的定位和遺傳分析中仍存在很多問題。多基因病易感基因的定位和遺傳分析成為近年來醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。　　多基因病涉及的主要為一些常見疾病,如原發(fā)性高血壓、糖尿病、哮喘、銀屑病、神經(jīng)及精神疾病等,其群體總患病率近612%[3]。它們雖有一定程度的家族傾向,但不遵從典型的孟德爾遺傳規(guī)律,其表型與基因型之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜,對其致病基因的

3、分離尚缺乏成熟的技術(shù),必需在人群與遺傳標(biāo)志的選擇、數(shù)學(xué)模型的建立、統(tǒng)計(jì)方法的改良等方面進(jìn)行不斷的探索和艱苦的工作。當(dāng)今國內(nèi)外學(xué)者所采取的基本策略主要是從改進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和遺傳分析方法等方面開展研究,其中常用的方法是大規(guī)模全基因組掃描和分型的連鎖分析[4，5],即首先選定研究樣本如家系、同胞對或人群,用遺傳位標(biāo)對樣本成員針對全基因組、某染色體區(qū)段或某候選基因進(jìn)行掃描,最后將所得數(shù)據(jù)用相應(yīng)統(tǒng)計(jì)方法分析,確定哪些區(qū)段或基因與所研究的疾病間存在連鎖或相關(guān)關(guān)系?！　∫?、全基因組掃描策略　　全基因組掃描(genomewidesearch)利用

4、DNA多態(tài)性標(biāo)記(主要是微衛(wèi)星DNA)或消減雜交等策略，對基因組逐個(gè)點(diǎn)進(jìn)行篩查，進(jìn)行全基因組掃描，尋找與疾病相關(guān)的易感基因。用多態(tài)性遺傳位標(biāo)對樣本個(gè)體進(jìn)行基因掃描和分型,定出每一個(gè)體遺傳位標(biāo)的等位基因。用統(tǒng)計(jì)軟件(如GENEHUNTER等)進(jìn)行遺傳統(tǒng)計(jì)分析,確定與疾病相連鎖的染色體區(qū)段,通過增加掃描密度或單倍型分析等方法,將定位區(qū)域盡可能縮小。遺傳位標(biāo)目前大多采用微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記(shorttandemrepeats,STR),單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)被認(rèn)為是很有前途的新

5、一代遺傳位標(biāo)。12　　1.樣本的收集和提取DNA樣本：當(dāng)前全基因組掃描基因定位主要是采用以家系為基礎(chǔ)的分析方式。　　選擇理想家系。所謂理想家系應(yīng)符合(1)診斷準(zhǔn)確，且為遷移較小、相對封閉的人群;(2)家系的數(shù)目及大小需達(dá)到一定要求;(3)有明確的遺傳相關(guān)數(shù)據(jù)，如遺傳方式、遺傳度、外顯率等。家系材料的收集應(yīng)盡可能全面，包括血液樣本、組織切片、分離的細(xì)胞株、臨床檢驗(yàn)結(jié)果等[6]?！　〈送?，還有以患病同胞對、核心家庭或以人群為基礎(chǔ)的分析形式，選擇相對應(yīng)的不同樣本。　　2.DNA短串聯(lián)重復(fù)序列STR方法：(1)選擇與制備。全基因組掃描中

6、利用的微衛(wèi)星標(biāo)記，是一種廣泛存在于人類基因組、以2～6個(gè)堿基為單位、串聯(lián)重復(fù)排列的序列，具有高度的多態(tài)性，并以孟德爾共顯性遺傳，可以作為一種遺傳標(biāo)記。目前商品化的ABIPRISMTMLinkageMappingSet(PE公司出品)共包含400個(gè)STR,分辨率達(dá)<10cm,可覆蓋人類整個(gè)基因組。然后合成STR的引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。(2)電泳檢測。PCR產(chǎn)物的檢測過程是在自動(dòng)激發(fā)熒光DNA測序儀上進(jìn)行的。與測序儀聯(lián)接的計(jì)算機(jī)可直觀地將每一產(chǎn)物的產(chǎn)量及分子量大小用曲線峰譜表示出來,再用相應(yīng)的軟件系統(tǒng)將電泳檢測到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理

7、。(3)自動(dòng)基因分型。用Genescan和Genotyper軟件對基因組掃描的結(jié)果進(jìn)行基因分型[7]。首先用Gene12scan軟件自動(dòng)分析電泳檢測結(jié)果，準(zhǔn)確測量每一泳道內(nèi)的分子量內(nèi)標(biāo)，依靠內(nèi)標(biāo)繪出分子量的回歸曲線;然后采用Genotyper軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行基因分型，據(jù)此得到家系中每個(gè)個(gè)體在400個(gè)基因位點(diǎn)的基因型。(4)基因組掃描綜合分析。經(jīng)上述處理后的數(shù)據(jù)輸入相應(yīng)的軟件(如LINKAGE等)，并與家系分析得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合處理，最常用的是連鎖分析。目前該方法經(jīng)過不斷的改進(jìn)和發(fā)展,并與其他分析方法，如相關(guān)分析及連鎖不平衡分析

8、等相結(jié)合,大大提高了在復(fù)雜性多基因遺傳病易感基因定位研究中的能力。它的主要缺點(diǎn)是費(fèi)用昂貴,現(xiàn)在并非每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都能夠辦得到的?！　≡谏鲜鰠^(qū)段內(nèi)選擇覆蓋密度更高的微衛(wèi)星標(biāo)記，進(jìn)行精細(xì)定位，盡量縮小致病基因的范圍，明確基因位點(diǎn)。第三代遺傳標(biāo)志系統(tǒng)—單個(gè)核苷酸多態(tài)性,因