重組人表皮生長因子外用溶液(i)

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1、重組人表皮生長因子外用溶液（Ⅰ）ChongzuRenBiaopiShengzhangyinziWaiyongrongye(Ⅰ)RecombinantHumanEpidermalGrowthFactorDerivativeforExternalUse，Liquid本品系由高效表達(dá)人表皮生長因子衍生物基因的大腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后制成。含適宜穩(wěn)定劑，不含防腐劑和抗生素。1基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。2制造2.1工程菌菌種2.1.1名稱及來源重組人表皮生長因子衍生物工程菌株系由帶有人工合成人表皮生長因子衍生物基因（較天然人表皮生

2、長因子5′N端多3個氨基酸序列：Ala-Arg-Ile）的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。2.1.2種子批的建立應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定。2.1.3菌種檢定主種子批和工作種子批的菌種應(yīng)進(jìn)行以下各項(xiàng)全面檢定。2.1.3.1劃種LB瓊脂平板應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無其他雜菌生長。2.1.3.2染色鏡檢應(yīng)為典型的革蘭陰性桿菌。2.1.3.3對抗生素的抗性應(yīng)與原始菌種相符。2.1.3.4電鏡檢查（工作種子批可免做）應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，無支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。2.1.3.5生化反應(yīng)應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀。2.1.3.6人表皮生長因子衍生物表達(dá)量在搖床中培

3、養(yǎng)，應(yīng)不低于原始菌種的表達(dá)量（10%）。2.1.3.7質(zhì)粒檢查該質(zhì)粒的酶切圖譜應(yīng)與原始重組質(zhì)粒相符。2.1.3.8目的基因核苷酸序列檢查（工作種子批可免做）目的基因核苷酸序列應(yīng)與批準(zhǔn)序列相符。2.2原液2.2.1種子液制備將檢定合格的工作種子批菌種接種于適宜的培養(yǎng)基（可含適宜抗生素）中培養(yǎng)，供發(fā)酵罐接種用。2.2.2發(fā)酵用培養(yǎng)基采用適宜的不含任何抗生素的培養(yǎng)基。2.2.3種子液接種及發(fā)酵培養(yǎng)2.2.3.1在滅菌培養(yǎng)基中接種適量種子液。2.2.3.2在適宜的溫度下進(jìn)行發(fā)酵，應(yīng)根據(jù)經(jīng)批準(zhǔn)的發(fā)酵工藝進(jìn)行，并確定相應(yīng)的發(fā)酵條件，如溫度、pH值、溶氧、補(bǔ)料、發(fā)酵時間等。發(fā)酵液應(yīng)定期進(jìn)行質(zhì)粒丟失

4、率檢查（附錄ⅨG）。2.2.4發(fā)酵液處理用適宜的方法收集處理菌體。收集的菌體原則上應(yīng)立即進(jìn)行初步純化，必要時可在-20℃凍存，并規(guī)定貯存期。2.2.5純化采用經(jīng)批準(zhǔn)的純化工藝進(jìn)行初步純化和高度純化，使其達(dá)到3.1項(xiàng)要求，即為人表皮生長因子衍生物原液。加入穩(wěn)定劑，除菌過濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。2.2.6原液檢定按3.1項(xiàng)進(jìn)行。2.3半成品2.3.1配制與除菌2.3.1.1稀釋液配制按經(jīng)批準(zhǔn)的配方配制稀釋液。配制后應(yīng)立即用于稀釋。2.3.1.2稀釋與除菌將檢定合格加穩(wěn)定劑的人表皮生長因子衍生物原液用2.3.1.1項(xiàng)稀釋液稀釋至所需濃度。除菌過濾后即為半成品，保存于2～8℃。2

5、.3.2半成品檢定按3.2項(xiàng)進(jìn)行。2.4成品2.4.1分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.4.2分裝應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。2.4.3規(guī)格應(yīng)為經(jīng)批準(zhǔn)的規(guī)格。2.4.4包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3檢定3.1原液檢定3.1.1生物學(xué)活性依法測定（附錄ⅩH）。3.1.2蛋白質(zhì)含量依法測定（附錄ⅥB第二法）。3.1.3比活性為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，每1mg蛋白質(zhì)應(yīng)不低于5.0×105IU。3.1.4純度3.1.4.1電泳法依法測定（附錄ⅣC）。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為17.5%，加樣量應(yīng)不低于10μg(考馬斯亮藍(lán)R250染色法)

6、或5μg(銀染法)。經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)不低于95.0%。3.1.4.2高效液相色譜法依法測定（附錄ⅢB）。色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以A相(三氟乙酸-水溶液：取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻)、B相(三氟乙酸-乙腈溶液：取1.0ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻)為流動相，在室溫條件下，進(jìn)行梯度洗脫(0～70％B相)。上樣量不低于10μg，于波長280nm處檢測，以人表皮生長因子衍生物色譜峰計算理論板數(shù)應(yīng)不低于500。按面積歸一化法計算，人表皮生長因子衍生物主峰面積應(yīng)不低于總面積的95.0%。3.1.5分子量依法測定（附錄ⅣC）。用還原

7、型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為17.5%，加樣量應(yīng)不低于1.0μg。分子質(zhì)量用重組人表皮生長因子衍生物對照品校正后應(yīng)為6.2kD±0.62kD。3.1.6外源性DNA殘留量每1支次人用劑量應(yīng)不高于10ng（附錄ⅨB）。3.1.7等電點(diǎn)主區(qū)帶應(yīng)為4.1～5.1,供試品的等電點(diǎn)與對照品的等電點(diǎn)圖譜一致。（附錄ⅣD）。3.1.8紫外光譜掃描用水或生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至約100μg/ml～500μg/ml，在光路1cm、波長230nm～360