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1、EGFP基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗研究作者：鄭立恒魏會平許松梅何波楊明理王黎明劉全勝【摘要】目的:探討外源性EGFP基因轉(zhuǎn)染修飾兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的可行性。方法:用增強(qiáng)型熒光綠色蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)作為報告基因，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果、表達(dá)情況及對靶細(xì)胞活力的影響。結(jié)果:經(jīng)熒光顯微鏡下觀察證實：成功地對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞實現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)染。結(jié)論:兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能
2、夠在體外適宜的條件下進(jìn)行長期培養(yǎng);骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可直接作為基因靶細(xì)胞,建立穩(wěn)定表達(dá)EGFP的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系具有可行性,為進(jìn)一步做標(biāo)記的MSCs細(xì)胞的移植研究奠定基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）；轉(zhuǎn)染；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）【ABSTRACT】Objective:Tostudythefeasibilityofexogenousgenetransfectingintobonemarrowmesenchymalstemcells(MSCs).Methods:MSCswerecu
3、lturedandtreatedwithpEGFPC1withthehelpoflipofectamine.Thetransgeneresultswereconfirmedbyfluoroscopyandthecellviabilityaftertransfectionwasevaluatedbylightmicroscopyandelectron6microscopy.Results:BonemarrowMSCsweresuccessfullytransfectedwithpEGFPC1gene
4、.Conclusion:TheMSCsoriginatedfromratbonecanbeculturedinvitrounderappropriateconditions,andtheycanbedirectlyusedasgenetargetcells.Moreover,itisfeasibletoconstructtheMSCsexpressingEGFPstably,whichcanbefurtherappliedtolabeltargetcellsinthetransplantation
5、study.【KEYWORDS】Enhancedgreenfluorescentprotein(EGFP);Transfection;Mesenchymalstemcells(MSCs)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSCs）由于具有自我更新，多向分化的潛能，且容易獲取和體外擴(kuò)增培養(yǎng)，成為近年來干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。迄今為止，國內(nèi)外已對MSCs培養(yǎng)、生物學(xué)特性及治療應(yīng)用等進(jìn)行了大量研究，展示了這種成體干細(xì)胞良好的應(yīng)用前景[1~4]。對MSCs研究主要包括：細(xì)胞特異性表面抗原、
6、體外大量擴(kuò)增技術(shù)、干細(xì)胞可塑性、細(xì)胞體內(nèi)分布功能和治療應(yīng)用等。我們利用建立的MSCs培養(yǎng)，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并篩選培養(yǎng)對其用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）進(jìn)行標(biāo)記，為其應(yīng)用于干細(xì)胞移植實驗打下良好基礎(chǔ)。1材料和方法611材料pEGFPC1質(zhì)粒（本室保存），G418購自GIBCOBRL公司，胎牛血清、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Roche公司，DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，PERCOLL細(xì)胞分離液購自天津TBD公司，日本大耳白兔購自四川大學(xué)動
7、物中心。12方法121兔骨髓MSCs的培養(yǎng)（1）原代培養(yǎng)：在無菌條件下，從日本大耳白兔股骨轉(zhuǎn)子處進(jìn)行骨穿，抽出骨髓細(xì)胞抗凝后用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，將細(xì)胞懸液緩慢加入離心管中PERCOLL分離液（密度1073g/ml）液面，進(jìn)行離心，DHanks液洗滌兩次，分離細(xì)胞，加入DMEM低糖型完全培養(yǎng)液（10%胎牛血清），接種于培養(yǎng)瓶中，48h后首次換液，以后每三天換液一次，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[5]。（2）傳代培養(yǎng)：待細(xì)胞克隆完全形成后，進(jìn)行胰酶消化傳代。當(dāng)?shù)诙?xì)胞長滿時，將
8、穩(wěn)定生長的細(xì)胞傳入25mm培養(yǎng)盤中，當(dāng)細(xì)胞生長至50%~80%融合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。122基因轉(zhuǎn)染按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作，實驗中設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照。123陽性克隆的篩選和熒光顯微鏡觀察6細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后用熒光顯微鏡觀察瞬時轉(zhuǎn)染效率，然后換篩選培養(yǎng)基，其中加入G418（400×106g/L），三天換液一次，維持篩選作用。期間用普通顯微鏡觀察細(xì)胞死亡情況。兩周后對照細(xì)胞完全死亡，轉(zhuǎn)染細(xì)胞單克隆形成，此時進(jìn)行熒光顯微鏡觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率并照相。2結(jié)果21MSCs細(xì)胞的形態(tài)觀察(1)
