微生物快速檢測方法及應用進展

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1、微生物快速檢測方法及應用進展【關(guān)鍵詞】微生物快速檢測隨著人們生活水平不斷提高，各種安全問題越來越受到人們的重視，微生物的污染問題也相應地備受關(guān)注。在食品和環(huán)境等各個方面都有微生物污染的可能，一旦污染，微生物將大量繁殖而導致食源性疾病或環(huán)境污染甚至醫(yī)院內(nèi)感染。特別是近年來隨著環(huán)境污染的加劇和生態(tài)平衡的不斷破壞，導致感染的致病菌的種類越來越多，病原微生物對人類的威脅越來越大。傳統(tǒng)的檢驗方法，主要包括形態(tài)檢查和生化方法，其準確性、靈敏性均較高，但涉及的實驗較多、操作煩瑣、需要時間較長、準備和收尾工作繁重，而且要有大量人員參與［1，2］。所以，迫切需

2、要準確、省時、省力和省成本的快速檢驗方法。本文對微生物快速檢測方法的進展情況及實際應用進行綜述，以利于預防食源性疾病及公共衛(wèi)生突發(fā)事件的發(fā)生。1即用型紙片法　　3M公司的perrifilmTMPlate系列微生物測試片，可分別檢測菌落總數(shù)、大腸菌群計數(shù)、霉菌和酵母計數(shù)［3］。由RCPScientificInc10公司開發(fā)上市的Regdigel系列，除上述項目外還有檢測乳桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌的產(chǎn)品［4］，這兩個系列的產(chǎn)品與傳統(tǒng)檢測方法之間的相關(guān)性非常好。如用大腸菌群快檢紙片檢測餐具的表面，操作簡便、快速、省料，特異性和敏感性與發(fā)酵法符合率高

3、，已經(jīng)被列為國標方法。使用時應正確掌握操作技術(shù)和判斷標準，從而達到理想的檢測效果［5］。美國3M公司生產(chǎn)的PF(Petrifilm)試紙還加入了染色劑、顯色劑，增強了菌落的目視效果，而且避免了熱瓊脂法不適宜受損細菌恢復的缺陷。霉菌快速檢驗紙片，應用于食品檢驗中的霉菌具有操作簡便，僅需36℃培養(yǎng)，不需要低溫設(shè)備；快速，僅需2d就可觀察結(jié)果，比現(xiàn)在的國家標準檢驗方法縮短3～5d，大大提高了工作效率。紙片法與國標法在霉菌檢出率上差異無統(tǒng)計學意義，且菌落典型，易判定。紙片熒光法利用細菌產(chǎn)生某些代謝酶或代謝產(chǎn)物的特點而建立的一種酶—底物反應法。只需檢測

4、食品中大腸菌群、大腸桿菌的有關(guān)酶的活性，將熒光產(chǎn)物在365nm紫外光下觀察即可。同時紙片可高壓滅菌處理，4℃保存，簡化了實驗準備、操作和判斷［6］。但由于它們價格昂貴，限制了在基層單位的實際應用。2生物化學技術(shù)2.1PCR技術(shù)10PCR技術(shù)采用體外酶促反應合成特異性DNA片段，再通過擴增產(chǎn)物來識別細菌。由于PCR靈敏度高，理論上可以檢出一個細菌的拷貝基因，因此在細菌的檢測中只需短時間增菌甚至不增菌，即可通過PCR進行篩選，節(jié)約了大量時間，但PCR技術(shù)也存在一些缺點：食物成分、增菌培養(yǎng)基成分和其他微生物DNA對Taq酶具有抑制作用，可能導致檢驗

5、結(jié)果假陰性；操作過程要求嚴格，微量的外源性DNA進入PCR后可以引起無限放大產(chǎn)生假陽性結(jié)果，擴增過程中有一定的裝配誤差，會對結(jié)果產(chǎn)生影響。由于以上原因，PCR技術(shù)對操作者的自身素質(zhì)要求很高，對于基層單位而言難以做到。短時間內(nèi)也不會有經(jīng)濟效益和社會效益，因此影響了這項技術(shù)在基層的應用。2.2基因探針技術(shù)基因探針技術(shù)利用具有同源性序列的核酸單鏈在適當條件下互補形成穩(wěn)定的DNARNA或DNADNA鏈的原理，采用高度特異性基因片段制備基因探針來識別細菌?；蛱结樀膬?yōu)點是減少了基因片段長度多態(tài)性所需要分析的條帶數(shù)。如法國生物一梅里埃公司的GENP

6、ROBE基因探針檢測系統(tǒng)，對于分離到的單個菌落，30min完成微生物的確證試驗［7］，基因探針的缺點是不能鑒定目標菌以外的其他菌。3選擇、鑒定用培養(yǎng)基法　　在培養(yǎng)基中加入特異性的生化反應底物、抗體、熒光反應底物、酶反應底物等，可使目標培養(yǎng)物的選擇、分離、鑒定一次性完成。如生物一梅里埃公司的BP+RPF(兔血漿+纖維蛋白原)培養(yǎng)基，可在24h內(nèi)鑒定金黃色葡萄球菌［8］。Merk公司的chromocultColiform10Agar培養(yǎng)基上，大腸桿菌為墨綠色至紫色菌落，沙門菌為淡綠色至藍綠色菌落。檸檬酸桿菌和克雷伯桿菌為橙紅色至紅色菌落，其他腸

7、道菌為無色菌落［9］。這個方法對操作者要求不高，短期培訓合格后即可上崗，從而取得一定的經(jīng)濟效益和社會效益，應用前景十分廣泛。4免疫學技術(shù)免疫學技術(shù)通過抗原和抗體的特異性結(jié)合反應，再輔以免疫放大技術(shù)來鑒別細菌。免疫方法的優(yōu)點是樣品在進行選擇性增菌后，不需分離，即可采用免疫技術(shù)進行篩選。由于免疫法有較高靈敏度，樣品經(jīng)增菌后可在較短的時間內(nèi)達到檢出度，抗原和抗體的結(jié)合反應可在很短時間內(nèi)完成［10］。此技術(shù)對操作者要求也不高，是目前為止基層單位應用時間最長最為廣泛的一項快速檢測技術(shù)。如采用免疫磁珠法可有效地收集、濃縮神奈川現(xiàn)象陽性的副溶血性弧菌，可顯

8、著提高環(huán)境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率［11］。膠體金免疫層析法能快速、靈敏檢測金黃色葡萄球菌［12］，應用膠體金免疫層析法檢測乙型肝炎表面抗原，可大大提