western blot 原理和操作方法(詳細)

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1、WesternBlot原理和操作方法（詳細）$5V?工作原理Y

2、-_2IU??蛋白質的電泳分離是重要的生物化學分離純化技術之一,電泳是指帶電粒子在電場作用下,向著與其電荷相反的電極移動的現象.根據所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)由于無電滲作用,樣品用量少(1-100μg),分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機械強度大,重復性好以及可以通過調節(jié)單體濃度或單體與交聯劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點而受到廣泛的應用.-O{`?'Q%9v?SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白

3、質的電泳方式,特別是用于蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量.}~<+{sQ?PAGE能有效的分離蛋白質,主要依據其分子量和電荷的差異,而SDS-PAGE(SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳)的分離原理則僅根據蛋白質的分子量的差異,因為SDS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇(2-ME)或二巰基赤蘚醇(DTT),其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,破壞蛋白質的四級結構,SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開分子內和分子間的氫鍵,破壞蛋白質分子的二級及三級結構,并與蛋白質的疏水部分相結合,破壞其折疊結構,電泳樣品假如樣品緩沖液后,

4、要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質充分結合形成SDS-蛋白質復合物,SDS-蛋白質復合物在強還原劑巰基乙醇存在時,蛋白質分子內的二硫鍵被打開而不被氧化,蛋白質也完全變性和解聚,并形成榛狀結構,穩(wěn)定的存在于均一的溶液中,SDS與蛋白質結合后使SDS-蛋白質復合物上帶有大量的負電荷,平均每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子,這時各種蛋白質分子本身的電荷完全被SDS掩蓋,遠遠超過其原來所帶的電荷,從而使蛋白質原來所帶的電荷可以忽略不計,消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質量的大小,這樣分離出的譜帶也為蛋白質的亞基.TIZO4Jz?樣品處理液

5、中通常加入溴酚藍染料,溴酚藍指示劑是一個較小的分子,可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當指示劑到達凝膠底部時,即可停止電泳.&$?@>&A?另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.?T&ZpP_]?重要參數(iLo=fd78?①聚丙烯酰胺凝膠(PAG)制備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度(T)以及雙體占總濃度的百分含量即交聯度(C)決定的,因而制膠之前必須首先知道這兩個參數.一般可以由下述公式計算:2`l#6?T%=(a+b)/m*100%;和C%=a/(a+

6、b)*100%&]*xjs{?其中:a=雙體(bis)的重量;b=單體(arc)的重量;m=溶液的體積(ml)uUo!k`lH?L0#p36e?②當分析一個未知樣品時,常常先用7.5%的標準凝膠制成4-10的梯度凝膠進行試驗,以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質的分子量已知,可參考下表選擇所需凝膠濃度:RKB6&r5k?2OJxL"mEc?蛋白質分子量范圍(Da)適宜的凝膠濃度(%)rQ9+x6?<10420-30"(pga?1×104-4×10415-20tu@v7?0:{F?4×104-1×10510-15y

7、5×1055-10V`>wj"?>5×1052-5LpS)D:xN?_#28fOo?③分離膠:N%<k[4?電泳凝膠濃度hR7z

8、dx*?試劑10%12%15%10%12%15%G9@,r}$E?H2O(ml)4.03.32.35.94.93.4zHVI2w?30%丙烯酰胺(T:30%,C:3%(ml)3.34.05.05.06.07.5ngl88w?1.5mol/lTris.cl(PH8.8)(ml)2.52.52.53.83.83.8Dj'3*=5?10%SDS(ml)0.10.10.10.150.150.155HHU.k

9、mp?10%AP(ml)0.10.10.10.150.150.15{t'9tNk@i?TEMED(μl)444666z!bT*`E