結(jié)核桿菌研究進(jìn)展(綜述)

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1、結(jié)核桿菌DNA疫苗研究進(jìn)展結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種人畜共患傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization，WHO）統(tǒng)計(jì)，全世界約有20億人感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，每年約有200～300萬(wàn)人死于結(jié)核病，其人數(shù)是其他傳染病死亡人數(shù)的總和。20世紀(jì)末，結(jié)核病仍然是全球感染和傳染病的第一“殺手”。當(dāng)前唯一可用的疫苗-卡介苗（BacilleCalmetteGuerin，BCG）的免疫效果下降，對(duì)其保護(hù)效果也存在爭(zhēng)議，經(jīng)試驗(yàn)證明其總有效率僅為50%。而且對(duì)成年人的免疫效果也不明確，因此現(xiàn)在急需研制出新型疫苗。目前新型結(jié)核疫苗研制方向主要有：減毒結(jié)核疫苗，高

2、表達(dá)重組疫苗，蛋白質(zhì)亞單位疫苗和DNA疫苗（又稱(chēng)核酸疫苗或基因疫苗）等四種。本文就結(jié)核DNA疫苗的新進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。1DNA疫苗的作用機(jī)理DNA疫苗的作用機(jī)理是能讓外源基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)出來(lái)的蛋白質(zhì)和MHC-Ⅰ類(lèi)分子結(jié)合后被呈遞到細(xì)胞的表面，再被CD8+T淋巴細(xì)胞的受體識(shí)別而誘發(fā)CTL的細(xì)胞毒反應(yīng)，這對(duì)細(xì)胞內(nèi)寄生的結(jié)核桿菌有很強(qiáng)的殺傷作用。但目前對(duì)DNA疫苗激活免疫系統(tǒng)的詳細(xì)機(jī)理還不是很清楚，不過(guò)有以下幾種機(jī)制可對(duì)此進(jìn)行解釋?zhuān)孩貲NA疫苗直接致敏體細(xì)胞；②基因疫苗轉(zhuǎn)染APC（抗原遞呈細(xì)胞-巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞）；核酸疫苗在APC內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原作為“內(nèi)源性

3、抗原”，結(jié)合MHC-Ⅰ類(lèi)分子后被T細(xì)胞受體識(shí)別，這是誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞的最有效的途徑；③交叉致敏；④細(xì)菌質(zhì)粒具有免疫佐劑功能[1]。當(dāng)人或小鼠感染結(jié)核菌后，巨噬細(xì)胞（MΦ）吞噬結(jié)核菌但卻不能將其殺滅。因此結(jié)核菌在MΦ中生存繁殖，外來(lái)藥物與抗體也無(wú)法直接消除結(jié)核菌。只有人MΦ被抗原特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞溶解后，其中寄生的毒性結(jié)核菌才能被殺死。因此可以設(shè)想，殺菌性T細(xì)胞的功能低下導(dǎo)致了小鼠感染結(jié)核菌后免疫抵抗力的下降，造成慢性感染，在人體也可發(fā)生類(lèi)似情況。在主動(dòng)免疫的機(jī)制中，可溶性蛋白抗原主要刺激CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，而DNA疫苗則可引起強(qiáng)烈的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的

4、抗原特異性CD8+/CD4-/CD44highT細(xì)胞，分泌IFN-γ[2]，引起有效的細(xì)胞免疫。2編碼抗原基因重組的DNA疫苗1996年8月出版的《自然醫(yī)學(xué)雜志》同時(shí)刊登了Huygen和Tascon兩位博士各自分別完成的結(jié)核病DNA疫苗的論文，1998年英國(guó)劍橋Sanger中心完成結(jié)核桿菌基因組序列的測(cè)定，為結(jié)核DNA疫苗的研制提供了保證，使其研制進(jìn)入飛躍發(fā)展階段。實(shí)驗(yàn)證明結(jié)核桿菌在體外培養(yǎng)早期分泌的蛋白質(zhì)是主要的抗結(jié)核保護(hù)性抗原，因此主要的結(jié)核DNA疫苗都是將編碼這些抗原的基因克隆到載體中構(gòu)建而成的。目前結(jié)核DNA疫苗的研制主要有：以Antigen85和hsp65，

5、以及結(jié)核桿菌培養(yǎng)過(guò)濾液中的分泌蛋白ESAT-6和MPT-64編碼基因重組的DNA疫苗[3]。2.1以Antigen85編碼基因構(gòu)建的DNA疫苗在結(jié)核菌和BCG的培養(yǎng)濾液中分泌蛋白的一個(gè)主要成分是Ag85復(fù)合體（Antigen85complex），由Ag85A，Ag85B，Ag85C組成的30～32kD蛋白家族，分別由三種不同但高度同源的基因編碼。在感染結(jié)核或麻風(fēng)菌與卡介苗免疫的小鼠及人體上，Ag85復(fù)合體不僅可以刺激產(chǎn)生體液免疫，尚可激發(fā)較強(qiáng)Th1型細(xì)胞免疫，引起CD8+T細(xì)胞增殖和IL-2及IFN-γ等細(xì)胞因子水平的上升。結(jié)核病的免疫學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能低下，研

6、究結(jié)果顯示CD8+T細(xì)胞的保護(hù)功能可能與IFN-γ誘導(dǎo)有關(guān)，這些實(shí)驗(yàn)揭示可利用Ag85復(fù)合體基因構(gòu)建DNA疫苗。其中Ag85A和Ag85B被認(rèn)為更有效，一些實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，由Ag85A和Ag85B編碼的DNA疫苗對(duì)小鼠抵抗由呼吸道或靜脈感染的結(jié)核菌有保護(hù)作用[4]，目前一些研究小組正在致力于此方面的研究。2.1.1Ag85A用含結(jié)核菌38kD蛋白基因與Ag85A及HSP65編碼基因構(gòu)建的DNA疫苗免疫的動(dòng)物模型中，可產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)作用。以人工合成的包括Ag85A全部20肽刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2，IFN-γ為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)DNA免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞反應(yīng)在強(qiáng)度和廣度上均比

7、皮下注射結(jié)核菌感染的效果好，CTL活性也上升。編碼Ag85A的DNA疫苗與BCG有同樣的誘導(dǎo)保護(hù)作用。Huygen把結(jié)核桿菌的抗原85A基因克隆到美國(guó)Merk公司的VIJ載體中構(gòu)建了DNA疫苗，然后將DNA在體外轉(zhuǎn)染肌肉瘤細(xì)胞，證明了DNA疫苗能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)結(jié)核桿菌的抗原85A蛋白質(zhì)。給Balb/c和C57BL/6小鼠肌肉注射Ag85A疫苗，能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)很強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。2.1.2Ag85B由MTB（Mycobacteriumtuberculosis）H37Rv基因組編碼，用其作為亞單位疫苗與多個(gè)蛋白疫苗比較或與其他基因疫苗比較[4