堿性蛋白酶活力的測定

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1、實驗四堿性蛋白酶活力的測定一、實驗原理以酪蛋白為底物測定堿性蛋白酶的活力。酪蛋白經(jīng)蛋白酶作用后，會降解成相對分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸，在反應(yīng)混合物中加入三氯醋酸溶液，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)和肽就沉淀下來，相對分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸仍留在溶液中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的數(shù)量正比于酶的數(shù)量和反應(yīng)時間。因而采用Folin法測定上清液中肽的含量就可以計算酶的活力。二、試劑和儀器試劑：0.1mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH10）、5%三氯醋酸、1%酪蛋白溶液（稱取5g酪蛋白置于500mL0.1mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH10）中，加熱使其溶解）、0.4

2、mol/L碳酸鈉溶液、100μg/mL酪氨酸溶液、Folin試劑，稀釋3倍使用儀器：水浴鍋、721分光光度計（含比色皿）、秒表、常規(guī)玻璃儀器三、實驗步驟1、酶液的萃取稱取1g粗酶制劑置于研缽中，加少量緩沖液一起研磨，然后定容至100mL，從容量瓶中取出5mL酶液（視酶活而定）再定容至100mL，稀釋后的酶液經(jīng)濾紙過濾后得到澄清的酶液。2、酶活力的測定樣品管：取不同量的酶液（0.1~1.0mL：0.2mL、0.4mL、0.6mL），用0.1mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH10）（對應(yīng)為0.8mL、0.6mL、0.4mL）補足體積到1.0mL，然后在每個樣品管中

3、再加入1mL預(yù)先在40℃保溫的1%酪蛋白溶液，混勻，在40℃準(zhǔn)確保溫10min，加入2mL5%三氯醋酸溶液，迅速搖勻，于室溫靜置半小時。空白管：先在每支試管中各加入1.0mL1%酪蛋白溶液和2.0mL5%三氯醋酸溶液，搖勻后，再加入1.0mL的酶液，酶液濃度分別與對應(yīng)的樣品管相同，在40℃下準(zhǔn)確保溫10min，以下操作同樣品管。將酶反應(yīng)混合物過濾后收集濾液，在1mL濾液中加5mL0.4mol/L碳酸鈉溶液和1mLFolin試劑，搖勻后在40℃恒溫水浴中顯色20min，以相應(yīng)的空白管中的反應(yīng)液為對照，在680nm下測定樣品管中反應(yīng)液的吸光度。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線為了確定酪氨

4、酸與OD值的對應(yīng)關(guān)系，需事先用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液與Folin試劑反應(yīng)顯色，測定OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液按下表配置：管號酪氨酸的濃度（微g/mL）100微g/mL酪氨酸溶液（mL數(shù)）蒸餾水（mL數(shù)）空白0011100.10.92200.20.83300.30.74400.40.65500.50.56600.60.4（2）向上表配制的不同濃度的酪氨酸溶液中分別加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5mL，F(xiàn)olin試劑1mL，置于40℃恒溫水浴顯色20min，在680nm下以空白為對照，測定各樣品管溶液的吸光度。（3）以吸光度（OD）為縱坐標(biāo)，酪氨酸

5、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由直線斜率計算K值。四、數(shù)據(jù)記錄與處理1、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算K值酪氨酸濃度/[μg/mL]0102030405060吸光度0.0000.0780.1770.2860.3610.4030.533用Excel擬合得，K=114.7（OD值為1時相當(dāng)?shù)奈⒖藬?shù)）。2、酶活力計算酶液加入量/mL相當(dāng)于粗酶制劑/克空白管OD值樣品管OD值凈OD值酶活力/[*104單位數(shù)/克酶制劑]平均酶活力/[*104單位數(shù)/克酶制劑]0.20.00010.0000.3610.36116.5613.480.40.00020.0000.5690.56913.050.6

6、0.00030.0000.7090.70910.84酶活力的計算：酶活力（單位數(shù)/克酶制劑）=4/10×K×OD×n式中：4——反應(yīng)混合物總體積為4mL；10——酶反應(yīng)時間為10min；K——標(biāo)準(zhǔn)曲線中OD值為1時相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)，結(jié)果為114.7；n——酶液的稀釋倍數(shù)五、討論1、酶反應(yīng)的溫度、pH和時間對被水解的肽鍵數(shù)量有直接的影響，因此必須嚴(yán)格控制。2、用三氯醋酸終止反應(yīng)后，過濾反應(yīng)混合物所得的濾液必須是澄清的。3、因為Folin試劑對酸性環(huán)境比較敏感，容易發(fā)生變化，因此在測定時有順序的規(guī)定，需要先加入碳酸鈉溶液形成一個堿性環(huán)境，之后再加入Folin試劑，使

7、其能正常發(fā)揮作用。