霉菌的形態(tài)觀(guān)察實(shí)驗(yàn)

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1、霉菌的形態(tài)觀(guān)察實(shí)驗(yàn)霉菌菌絲比較粗大（菌絲和孢子的直徑達(dá)到3-10μm），通常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因而可用低倍、高倍鏡觀(guān)察。霉菌菌絲細(xì)胞容易收縮變形，孢子容易飛揚(yáng)，在制備霉菌標(biāo)本時(shí)，常用乳酸石炭酸溶液作為介質(zhì)，具有不使細(xì)胞變形，可殺菌防腐，不易干燥，能保持較長(zhǎng)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)并掌握觀(guān)察霉菌形態(tài)的基本方法；2.了解常見(jiàn)霉菌（根霉、毛霉、曲霉、青霉、紅曲霉、白地霉）的基本形態(tài)特征。二、實(shí)驗(yàn)材料1.菌種：根霉（Rhizopussp.）、毛霉（Mucorsp.）、曲霉（Aspergillussp

2、.）、青霉（Penicilliumsp.）、紅曲霉（Monascussp.）的平板培養(yǎng)物，白地霉（Geotrichumcandidum）搖瓶培養(yǎng)液。2.培養(yǎng)基：土豆瓊脂培養(yǎng)基（PDA）或察氏培養(yǎng)基。3.溶液或試劑：乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。4.其他：無(wú)菌吸管，平皿，載玻片，蓋玻片，解剖針，顯微鏡等。三、實(shí)驗(yàn)原理霉菌菌絲比較粗大（菌絲和孢子的直徑達(dá)到3-10μm），通常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因而可用低倍、高倍鏡觀(guān)察。霉菌菌絲細(xì)胞容易收縮變形，孢子容易飛揚(yáng)，在制備霉菌標(biāo)本時(shí)，常用乳酸石炭酸溶液作為介質(zhì)，具有不使

3、細(xì)胞變形，可殺菌防腐，不易干燥，能保持較長(zhǎng)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。若加入棉藍(lán)，又具有一定的染色效果。霉菌的有些結(jié)構(gòu)在制片過(guò)程中易被破壞，影響觀(guān)察，可采用載片培養(yǎng)法。此法便于直接在顯微鏡下觀(guān)察，尤其適用于根霉的假根、曲霉的足細(xì)胞及分生孢子鏈等結(jié)構(gòu)的著生和生長(zhǎng)情況的觀(guān)察。并且還可以在同一標(biāo)本上觀(guān)察到微生物發(fā)育的不同階段的形態(tài)。四、操作步驟（一）一般觀(guān)察法：1.點(diǎn)種培養(yǎng)：用接種針沾取斜面少許孢子在無(wú)菌的察氏培養(yǎng)基中央穿刺接種（倒置培養(yǎng)皿穿刺接種），30℃下培養(yǎng)7-10天，形成巨大菌落培養(yǎng)物。2.直接制片：在載玻片中央加一滴乳酸石

4、炭酸棉藍(lán)染色液于潔凈，打開(kāi)霉菌平板培養(yǎng)物，用解剖針從菌落的邊緣挑取少量帶有孢子的菌絲，放入載玻片的染液中，細(xì)心地把菌絲挑散開(kāi)，加蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡，置于顯微鏡下觀(guān)察，菌絲呈蘭色，顏色的深度隨菌齡的增加而減弱。觀(guān)察根霉時(shí)，注意觀(guān)察其菌絲有無(wú)橫隔、假根、孢子囊柄、孢子囊、囊軸、囊托、孢子囊孢子及厚垣孢子。觀(guān)察毛霉時(shí)，注意觀(guān)察其菌絲無(wú)橫隔、孢子囊柄、囊軸、孢子囊孢子及后垣孢子。觀(guān)察曲霉時(shí)，注意觀(guān)察其菌絲有橫隔、足細(xì)胞、分生孢子梗、頂囊、小梗（形狀、層數(shù)及著生情況）、分生孢子。觀(guān)察青霉時(shí)，注意觀(guān)察其菌絲有橫隔、分

5、生孢子梗、帚狀枝（小梗的輪數(shù)及對(duì)稱(chēng)性）、分生孢子。觀(guān)察紅曲霉時(shí)，注意觀(guān)察其菌絲有橫隔、分生孢子著生情況、閉囊殼、子囊孢子。（二）載玻片濕室培養(yǎng)觀(guān)察法也稱(chēng)載片培養(yǎng)法，用無(wú)菌操作將培養(yǎng)基瓊脂薄層置于載玻片上，接種后蓋上蓋玻片培養(yǎng)，霉菌即在載玻片和蓋玻片之間的有限空間內(nèi)沿蓋玻片橫向生長(zhǎng)。培養(yǎng)一定時(shí)間后，將載玻片上的培養(yǎng)物置于顯微鏡下觀(guān)察。載片培養(yǎng)法制備的標(biāo)本片可直接在顯微鏡下觀(guān)察，這種培養(yǎng)觀(guān)察方法保持了霉菌的自然生長(zhǎng)狀態(tài)，尤其適用于根霉的假根、匍匐菌絲，曲霉的足細(xì)胞的觀(guān)察，并且還可在同一標(biāo)本片上觀(guān)察霉菌的不同生長(zhǎng)階段

6、的形態(tài)。載玻片濕室培養(yǎng)觀(guān)察法具體操作：1.準(zhǔn)備濕室：在培養(yǎng)皿底部鋪一張圓形濾紙片，濾紙片上依次放上“U”形載玻片擱架、載玻片、蓋玻片（兩片），蓋上皿蓋，外用紙包扎，高壓滅菌（9.8×104Pa）20分鐘后，60℃烘箱干燥，備用。2.取菌接種：用接種環(huán)挑取少量待觀(guān)察的霉菌孢子，置于濕室的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時(shí)只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可。（接種量要少，以免培養(yǎng)后菌絲過(guò)于稠密而影響觀(guān)察）3.加培養(yǎng)基：用無(wú)菌細(xì)口滴管吸取少許融化并冷卻至45℃的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培

7、養(yǎng)基應(yīng)滴得圓而薄，直徑約為0.5cm（滴加量一般以1/2小滴為宜），注意無(wú)菌操作。4.加蓋玻片：在培養(yǎng)基未徹底凝固前，用無(wú)菌鑷子將皿內(nèi)的蓋玻片蓋在瓊脂薄層上，用鑷子輕壓蓋玻片，使蓋玻片和載玻片之間的距離相當(dāng)接近，但不能壓扁。（蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此留有小縫隙，一是為了通氣，二是使各部分結(jié)構(gòu)平行排列，易于觀(guān)察。）5.倒保濕劑：每皿倒入約3mL20%的無(wú)菌甘油，使皿內(nèi)濾紙完全濕潤(rùn)，以保持皿內(nèi)濕度，蓋上皿蓋。制成載玻片濕室，28℃培養(yǎng)。觀(guān)察：將培養(yǎng)好的載玻片取出，置于顯微鏡下直接觀(guān)察。