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《免疫細(xì)胞體外誘導(dǎo)及培養(yǎng)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、過繼性T細(xì)胞治療是過繼性細(xì)胞免疫治療研究的重點(diǎn)，但對(duì)MHCI類分子陰性的腫瘤細(xì)胞無效，而NK細(xì)胞(Naturalkillercell,NK細(xì)胞)由于表達(dá)MHCI類分子的抑制性受體-殺傷細(xì)胞抑制性受體(Killerinhibitoryreceptor,KIR)，可以殺滅MHCI類分子陰性的腫瘤，隨著對(duì)NK細(xì)胞研究的深入，目前NK細(xì)胞用于腫瘤免疫治療成為研究熱點(diǎn)。19世紀(jì)80年代興起的細(xì)胞過繼免疫治療帶給了腫瘤患者一個(gè)新的希望。自然殺傷(naturalkiller,NK)細(xì)胞作為機(jī)體抗腫瘤的第一道防線，
2、再加上其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用是由其表面抑制性受體和活化性受體的共同信號(hào)決定，所以NK細(xì)胞成為近年細(xì)胞過繼免疫治療的研究熱點(diǎn)。自然殺傷細(xì)胞表面標(biāo)志與分類???1．依據(jù)表面標(biāo)志分為CD56bright和CD56dim兩個(gè)亞群?NK細(xì)胞表達(dá)眾多表面分子，但只具有相對(duì)特異性。通常將CD56+CDl6+CD3-TCR―BCR―的淋巴樣細(xì)胞定為NK細(xì)胞，并以CD56的表達(dá)密度不同，將NK分為CD56bright和CD56dim兩群。CD56brightNK細(xì)胞高表達(dá)CD56、CD94／NKG2A和L選擇素(CD
3、62L)；低表達(dá)CDl6和KIR；表達(dá)高親和力的IL2受體(1L-2RapY)。而CD56dimNK細(xì)胞高表達(dá)CDl6、PEN5、KIR和LFA―1；低表達(dá)CD56，CD94／NKG2A；僅表達(dá)不帶。鏈的中親和力的IL-2受體(IL-2Rβγ)。?NK細(xì)胞亞群CD56bright和aD56dim的表型特點(diǎn)????2．依據(jù)細(xì)胞因子分泌格局分為NKl和NK2兩個(gè)亞群?NK細(xì)胞也存在著類似Thl和Th2樣的亞群。分離外周CDl6+，或CD56+細(xì)胞，用ILl2和抗IL―4抗體可以誘導(dǎo)出分泌IFN―Y的Th
4、l型NK亞群，用IL4和抗體誘導(dǎo)出分泌IL5、ILl3的Th2型NK細(xì)胞亞群，分別命名為NKl和NK2。也有人認(rèn)為NK細(xì)胞發(fā)育經(jīng)歷K2一NK0一NKl的過程。在這一過程中IL4促進(jìn)NK2增殖；ILl2促使NK2向NKl轉(zhuǎn)變，并促進(jìn)NKl的或熟。????3．依據(jù)黏附功能分為黏附NK和非黏附NK兩個(gè)亞群?根據(jù)NK細(xì)胞在IL2的誘導(dǎo)下表現(xiàn)出的黏附能力，分為黏附NK(A―NK)和非黏附NK(NA―NK)兩個(gè)亞群。A―NK細(xì)胞的表型比較均一，主要為CD3―CD56dimCDl6十IL2R+，不含CD56bri
5、ght細(xì)胞。NA―NK細(xì)胞是具有不同表型的異質(zhì)性群體，各種表型如CD56bright、CD56dim、CD56―、CDl6十、CDl6―均可存在。方法：1.采取10例健康志愿者和山西省腫瘤醫(yī)院血液科10例AML患者外周血15ml,運(yùn)用常規(guī)單個(gè)核細(xì)胞提取法提取單個(gè)核細(xì)胞，分別放于含有SCGM培養(yǎng)基locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquo
6、rwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame的培養(yǎng)孔中培養(yǎng)，前5d加入0.5ulCD3McAb，在培養(yǎng)的第5d，倒掉含有CD3McAb的培養(yǎng)液，加入含有rhIL-2的SCGM培養(yǎng)基。隔日補(bǔ)充一次培養(yǎng)液，直至第25d。2.運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)培養(yǎng)第0d、5d、10d、15d、20d及第25d的細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞存活率。3.運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)第0d、5d、10
7、d、15d、20d及25d細(xì)胞中的NK細(xì)胞百分率和T細(xì)胞百分率。4.采用比色法檢測(cè)培養(yǎng)第0d、5d、10d、15d、20d及25d分選出的NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和RPMI8226細(xì)胞的殺傷活性。健康志愿者即健康人群NK細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時(shí)間間期是20d。1．細(xì)胞增殖活性的測(cè)定采用改進(jìn)的四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法于培養(yǎng)的第1，4，7，10和第14天分別取細(xì)胞，充分洗滌，以1×106/ml濃度加入96孔平底板中，每孔0.2ml，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔加MTT（5mg/ml）20ul，繼續(xù)
8、培養(yǎng)4h，然后翻板，每孔滴加100ul二甲基亞砜（DMSO）輕輕振蕩10min后在酶標(biāo)儀上570nm處測(cè)定吸光度（OD值），取3孔均值，OD值高則增殖快。2.細(xì)胞殺傷活性的測(cè)定采用MTT法進(jìn)行免疫活性細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定靶細(xì)胞為Anip973和K562腫瘤細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞為完全培養(yǎng)基和AIMV分別培養(yǎng)的A-NK細(xì)胞和NA-NK細(xì)胞，效靶比例為100:1。設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞共同孵育孔（E+T），效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔（E）和靶細(xì)胞對(duì)照孔（T），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，操作方法同1.4。測(cè)
