中華絨螯蟹表達序列標簽(est)分析及免疫相關基因的克隆、表達模式研究

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5、fatal,whennightcame【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是我國的重要增養(yǎng)殖對象之一。近年來,隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和集約化程度的提高,由細菌、病毒和類立克次體生物等引起的各種病害日趨嚴重,給中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。至今,病害仍然是困擾其養(yǎng)殖業(yè)的一個重要因素。除改善環(huán)境因素外,提高機體自身免疫力和抗病力是解決這一難題的一個重要方法。本論文試圖從分子角度來研究中華絨螯蟹的免疫防御機制,以其為這一重要方法提供堅實的理論基礎。本研究借助分子生物學和生物信息學手段,首次完成對中華絨螯蟹血細胞cDNA文庫的構建和表達序列標簽(EST

6、)的分析,不僅豐富了中華絨螯蟹的基因數(shù)據(jù),同時篩選出許多與免疫相關的基因序列。在此基礎上,通過cDNA末端快速擴增(RACE)和實時定量PCR技術進一步對主要的免疫相關基因進行了克隆和表達模式分析,這些研究為了解中華絨螯蟹免疫機制提供了基礎資料,同時也為蟹病的防治提供了新思路。主要研究結果如下:1采用常規(guī)cDNA文庫構建技術,成功構建了滴度為4.50×10~6CFU/mL,庫容為3.3×10~6CFU/mL,重組率為73%的中華絨螯蟹血細胞cDNA文庫;從文庫中隨機挑取了3,118個克隆進行5’-端單向測序,經(jīng)去除低質(zhì)量和污染序列后,共得到3,041條高質(zhì)量EST序列,這

7、些序列的平均長度為561bp。經(jīng)拼接后獲得了1,049條unique序列,包括292條重疊群(Contig)和757條單一序列(Singleton)。通過比對發(fā)現(xiàn)有488條Unique序列被注釋成已知的功能基因,551條Unique序列未被注釋任何功能;通過GeneOntology功能分類發(fā)現(xiàn)了26個中華絨螯蟹先天性免疫反應,如參與酚氧化酶系統(tǒng)的絲氨酸蛋白酶、Kazal-型蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、α-巨球蛋白、酚氧化酶原激活因子以及酚氧化酶酶原,參與凝集反應的谷胱酰胺轉移酶,與抗氧化系統(tǒng)相關的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽