木質(zhì)纖維素水解液中抑制劑對丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)正丁醇的脅迫機制研究

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1、ｓＴｌＡｈＪＪＩｒｊＵＮＩＶＥ中國第－所現(xiàn)代大學Ｒ５ＩＴＹＦＯＵＮＤＥＤＩＮ１８９５博士學位論文一級學科化學工程與技術：學科專業(yè)：生物化工作者姓名：劉歡歡指導教師：＿ｉＭ天津大學研究生院２０１７年５月木質(zhì)纖維素水解液中抑制劑對丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)正丁醇的脅迫機制研究StressmechanismoftheinhibitorsinlignocellulosehydrolysatesonthebutanolproductionbyClostridiumacetobutylicum一級學科：化學工程與技術學科專業(yè)：生

2、物化工研究生：劉歡歡指導教師：聞建平天津大學化工學院2017年5月摘要本文采用系統(tǒng)生物學方法，研究了木質(zhì)纖維素水解液中的抑制劑對丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)正丁醇的脅迫機理，為菌株進化、木質(zhì)纖維素水解工藝和發(fā)酵工藝改造提供了理論依據(jù)。首先我們宏觀考察了木質(zhì)纖維素水解液中普遍存在的三類抑制劑—呋喃、弱酸和苯酚等脅迫下，菌株發(fā)酵產(chǎn)正丁醇的動力學行為。結(jié)果顯示，木質(zhì)纖維素水解液中對菌體毒性最大的抑制劑為甲酸和苯酚，0.5g/L的甲酸或苯酚足以顯著抑制正丁醇生產(chǎn)；而呋喃類化合物在低濃度時（糠醛或5-羥甲基糠醛濃度小于1g/L時）可促進菌體生長和正丁醇生產(chǎn)，當濃度高于1g/L以后

3、，其對正丁醇發(fā)酵的抑制效應凸顯。為解析抑制劑脅迫下與菌體生長和丁醇生產(chǎn)相關的胞內(nèi)代謝機制，我們選取了具有代表性的糠醛（1.5g/L）、甲酸（0.5g/L）和苯酚（0.5g/L）作為木質(zhì)纖維素水解液中主要抑制劑，分別進行了比較代謝組學研究，并鑒定出了對抑制劑的脅迫響應具有密切聯(lián)系的胞內(nèi)代謝物。結(jié)果表明：3種抑制劑均對胞內(nèi)氨基酸代謝、糖代謝、二碳代謝和脂肪酸代謝造成顯著影響。特別地，糠醛的添加還顯著影響了胞內(nèi)還原性化合物相關的代謝模塊；苯酚影響顯著的為脂肪酸代謝和核酸代謝；而甲酸脅迫下，胞內(nèi)代謝活動明顯緊縮，造成菌體及正丁醇合成受阻。由于胞內(nèi)代謝改向取決于胞內(nèi)的酶

4、和蛋白變化，我們進一步分析了這三種抑制劑脅迫下的胞內(nèi)蛋白組輪廓。結(jié)果發(fā)現(xiàn)涉及下游糖酵解、還原-TCA循環(huán)、ATP合成、丙酮-丁醇合成、氧化還原相關的關鍵酶/蛋白含量均較對照組低，解釋了胞內(nèi)代謝脅迫機制及丁醇低產(chǎn)原因；而糖異生、氧化-TCA循環(huán)、核酸代謝、脂肪酸合成、含硫氨基酸合成、負責氧化應激的TPX蛋白以及分子伴侶（DnaK，GroEL及HtpG）等蛋白表達均顯著上調(diào)，表明抑制劑脅迫誘發(fā)了菌株的應激響應及代謝調(diào)整機制。特別地，在苯酚脅迫下，尼克酸代謝、細胞壁合成、芽孢合成及鞭毛合成等蛋白表達模式與甲酸和糠醛脅迫具有明顯差異；而甲酸和糠醛脅迫下的這些模塊蛋白表

5、達模式較為接近，表明了這三種抑制劑脅迫機理的特異性。最后，針對木質(zhì)纖維素水解液中種類豐富且毒性較大的不同結(jié)構(gòu)的酚類物質(zhì)，我們選取了其中四種具有代表性的化合物（香草醛、丁香醛、阿魏酸和p-香豆酸），對它們的脅迫機制進行了全基因組的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果顯示，四種酚類化合物均對中心碳及能量代謝具有較強的抑制；而對硫代謝、半胱氨酸/甲硫氨酸合成、脂肪酸合成、核黃素合成、乙醛酸合成、RNA降解及磷酸戊糖途徑I中的關鍵基因均具有激活效應。特別是，芽孢形成和嘌呤代謝僅在丁香醛和香草酸脅迫下被激活；與壓力應激相關的分子伴侶僅在香草醛、阿魏酸和p-香豆酸中被激活；甘油

6、酯合成相關基因也僅在香草醛、丁香醛和阿魏酸中的表達水平顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明四種酚類化合物在菌體的胞內(nèi)代謝調(diào)整與轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制上具有明顯的共性，也具有各自的特異性，這為針對木質(zhì)纖維素水解液中酚類抑制劑的菌株耐受性強化提供了改造依據(jù)。關鍵詞：木質(zhì)纖維素水解液，抑制劑，生物丁醇，系統(tǒng)生物學，丙酮丁醇梭菌IIABSTRACTClostridiumacetobutylicum,knownasitsexcellentethanol-acetone-butanolproducingcapacity,isinvestigatedatthepresenceofdifferent

7、inhibitorsinthelignocellulosehydrolysatesbythemethodofsystemsbiotechnologies.ThesystematicanalysisofC.acetobutylicumresponsetotheinhibitorstress(furans,weakacidsandphenol)providesatheoreticalbasisforthedevelopmentoflignocellulosepretreatmenttechniques,fermentationtechniquesandstrain

8、evolutioninbio-buta