兔角膜上皮細(xì)胞體外原代培養(yǎng)方法的研究.doc

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1、兔角膜上皮細(xì)胞體外原代培養(yǎng)方法的研究【摘要】目的:建立體外原代培養(yǎng)兔角膜上皮細(xì)胞簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法,并觀察其體外生長(zhǎng)的生物學(xué)特性。方法:采用消化法、組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)兔角膜上皮細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng),分別測(cè)定細(xì)胞分裂指數(shù)及細(xì)胞貼壁率,MTT比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果:兩種方法培養(yǎng)的細(xì)胞在原代、第1代形態(tài)相似，消化法培養(yǎng)的細(xì)胞代數(shù)維持低于組織塊法；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，組織塊培養(yǎng)法的細(xì)胞具有更好的活力且分裂旺盛（P<0.05）；在16h后，消化法培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁率低于組織塊培養(yǎng)法（P<0.05）。結(jié)論:選擇組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)兔角膜上

2、皮細(xì)胞可獲得狀態(tài)良好的連續(xù)傳代擴(kuò)增的細(xì)胞，且具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用性；角膜上皮細(xì)胞符合一般有限細(xì)胞系的生長(zhǎng)規(guī)律。【關(guān)鍵詞】角膜；上皮細(xì)胞；原代細(xì)胞培養(yǎng)；兔角膜細(xì)胞成分培養(yǎng)是現(xiàn)代角膜病研究和治療的基礎(chǔ)，近年來(lái)，隨著研究深入，對(duì)角膜細(xì)胞成分培養(yǎng)提出了更高要求。在此，我們探索了體外原代培養(yǎng)兔角膜上皮細(xì)胞的兩種方法，以期建立一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的兔角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康新西蘭白兔6只，雌雄不限，體重2.0～2.5kg,由東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供與飼養(yǎng)。眼部經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查顯

3、示屈光間質(zhì)透明，無(wú)眼前節(jié)病變。1.1.2主要試劑和儀器DMEM/F12（Gibco,USA)，胎牛血清（中美合資蘭州民海生物），胰蛋白酶（Gibco,USA），EDTA（乙二胺四乙酸二鈉，AMRESCO分裝），MTT（Sigma，USA），CO2培養(yǎng)箱（HealForceHF121UV），倒置相差顯微鏡（OLYMPUSCKX41，Japan），酶標(biāo)儀（Bio-radModel860）。1.1.3培養(yǎng)液的制備采用DMEM/F12=1∶1的混合液，內(nèi)含10mmo1·L-1HEPES、20%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素和

4、100×103U·L-1鏈霉素，pH值7.2～7.4。71.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1取材取新西蘭白兔6只，共12眼，以空氣栓塞法處死兔，無(wú)菌條件下迅速摘取眼球，用PBS反復(fù)沖洗后浸泡于含青、鏈霉素1000×103U·L-14℃PBS中10min,待用。1.2.2消化法原代培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞在超凈工作臺(tái)上將眼球用PBS沖洗2～3次，沿角膜緣取下完整角膜，用DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗1～2次；在50mm培養(yǎng)皿中加0.25%胰蛋白酶或0.1％胰蛋白酶－0.02％EDTA混合消化液約1ml，將上述處理過的兔眼角膜上皮面朝下置于消化液中，培養(yǎng)

5、箱中消化20～30min后翻轉(zhuǎn)角膜片，輕輕沖洗上皮面，將沖洗液移至加有適量胎牛血清的離心管終止消化；在培養(yǎng)皿中再次加入消化液，置培養(yǎng)箱中消化10min后終止消化；將兩次消化的細(xì)胞懸液離心6～8min(1000r·min-1)，棄上清，加入全培養(yǎng)液（內(nèi)含10mmo1·L-1HEPES、20%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素、100×103U·L-1鏈霉素，pH值7.2～7.4），吹打混勻。計(jì)數(shù)制成5×105～1×106ml-1細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中。置37℃、5%CO2和95%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后首次換液，以后每周

6、更換2～3次。1.2.3組織塊貼壁法原代培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞在超凈工作臺(tái)上，將眼球用PBS沖洗2～3次后沿角膜緣取下完整角膜，放入加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；在體式顯微鏡下完整撕下角膜上皮面，剪成約1mm3大小角膜上皮片，均勻平鋪于培養(yǎng)瓶中，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入全培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4h后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液慢慢浸過組織塊；或?qū)⒔悄ど掀て鶆蚱戒佊?4孔板中，置于培養(yǎng)箱中2～4h，然后緩緩加入全培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶或24孔板置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后首次換液，以后每周更換2～3次。1.2.4角膜上皮細(xì)胞的傳代原代培養(yǎng)

7、至上皮細(xì)胞80％融合后用PBS沖洗2次，加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA1ml沖洗1次，再加入消化液1～2ml，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙變大或少量細(xì)胞脫壁時(shí)加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞懸液，離心6～8min(1000r·min-1)，計(jì)數(shù)，接種于培養(yǎng)瓶中（按1∶2或1∶3傳代），3d后首次換液，以后每周更換2～3次，直至細(xì)胞融合。1.2.5觀察方法1.2.5.1形態(tài)觀察每日用倒置顯微鏡觀察活細(xì)胞生長(zhǎng)情況，拍照記錄。1.2.5.2MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線7取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的上皮細(xì)胞，采用上述

8、傳代方法消化，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以103ml-1接種于96孔板，每板設(shè)復(fù)孔且每孔的細(xì)胞數(shù)保持一致，加入等量培養(yǎng)液（200μl·孔-1）置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每天取出1塊板，每孔加入MTT溶液（5mg·ml-1）20μl，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，小心吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入