slanDC在HIV感染靶細(xì)胞中作用的研究

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1、分類號：R512.91單位代碼：10159密級：公開學(xué)號：201520179碩士學(xué)位論文中文題目：slanDC在HIV感染靶細(xì)胞中作用的研究英文題目：StudyontheroleofslanDCinHIVinfectedtargetcells論文作者：汪媛媛指導(dǎo)教師：耿文清教授學(xué)科專業(yè)：醫(yī)學(xué)實驗學(xué)完成時間：2018年3月中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文slanDC在HIV感染靶細(xì)胞中作用的研究StudyontheroleofslanDCinHIVinfectedtargetcells論文作者汪媛媛指導(dǎo)教師耿文清申請學(xué)位醫(yī)學(xué)碩士培養(yǎng)單位第一臨床學(xué)院一級學(xué)科基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)二級學(xué)科醫(yī)學(xué)實驗學(xué)研究

2、方向slanDC在HIV感染中的作用論文起止時間2016年3月-2018年2月論文完成時間2018年2月中國醫(yī)科大學(xué)（遼寧）2018年4月中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要目的：病毒在細(xì)胞與細(xì)胞間的傳播是人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）在人體內(nèi)播散的重要途徑。樹突狀細(xì)胞（dendriticcell，DC）是人體內(nèi)功能最強的抗原提呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖活化，啟動初次免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，但同樣也會在HIV向靶細(xì)胞傳播的過程中起到橋梁的作用。傳統(tǒng)的DC主要分為髓系來源的DC（MyeloidDC，MDC）及類漿細(xì)胞樣DC（Plasmac

3、ytoidDC，PDC）。但后來KnutSch?kel等又發(fā)現(xiàn)一群新的DC亞群，其細(xì)胞表面特異性表達(dá)6-磺基N-乙酰乳糖胺（6-sulfoLacNAc），因而被稱為slanDC，可以用單克隆抗體M-DC8來識別。不同于傳統(tǒng)DC，slanDC表達(dá)CD16，細(xì)胞學(xué)特征更類似單核細(xì)胞，具有髓系來源細(xì)胞的特征，并且在外周血中的數(shù)量比MDC和PDC多，約占外周血單個核細(xì)胞（Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）的0.6%-2%。體外研究結(jié)果顯示，單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞（monocyte-deriveddendriticcell，MDDC）在HIV的反式

4、傳播中起到重要作用。提示slanDC在HIV向靶細(xì)胞的傳播中可能發(fā)揮重要作用。HIV病毒在細(xì)胞間的傳播有種主要機制。第一種，即順式傳播，HIV-1感染靶細(xì)胞，其RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成DNA整合到靶細(xì)胞DNA上，跟隨宿主細(xì)胞復(fù)制產(chǎn)生子代病毒釋放到細(xì)胞外臨近另外一個靶細(xì)胞的地方，從而感染新的靶細(xì)胞。第二種反式傳播，病毒在細(xì)胞中并不完成逆轉(zhuǎn)錄、整合、復(fù)制等，而是僅僅將細(xì)胞作為橋梁，通過一些表面分子捕獲HIV病毒并保留在細(xì)胞表面，在靠近另一個靶細(xì)胞時形成病毒學(xué)突觸，通過這種密切接觸傳播病毒。slanDC上表達(dá)DC-SIGN，這是一種在HIV向靶細(xì)胞傳播中起重要作用的分子。而證據(jù)表明單核、

5、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞（monocytederiveddendriticcells，MDDC）均能通過siglec1向靶細(xì)胞傳遞HIV。本研究擬通過對HIV感染者的研究，明確HIV感染者以及HAART治療有效者slanDC表面是否表達(dá)siglec1及水平；通過的slanDC染毒后與靶細(xì)胞共培養(yǎng)的體外實驗，明確slanDC是否能在HIV的細(xì)胞間傳播中起作用，探討這種作用是否與siglec1相關(guān)，為揭示slanDC在HIV感染過程中細(xì)胞間的傳播途徑提供依據(jù)。研究方法：1、研究對象。14例HIV感染未治療者，28例高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（highlyactiveantire

6、troviraltherapy，HAART）有效者，均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診。健康對照組（NC）19例，為隨機抽取的HIV抗體陰性、I中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文未暴露于HIV的健康人。2、CD4+T細(xì)胞絕對值的檢測。將20μlBD公司CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP試劑加入絕對計數(shù)管中，逆向加樣法加入50μl混勻的抗凝全血，室溫避光15min，加入1×免洗溶血素450μl，室溫避光15min，應(yīng)用FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，MultiSET軟件分析結(jié)果，得到CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對值。3、HIV-1病毒載量測定。以1200μl血漿采用標(biāo)

7、準(zhǔn)版模板制備法提取RNA，采用Roche公司TheCOBAS?AmpliPrep?/COBAS?TaqMan?HIV-1Test試劑盒在RocheCOBAS?AmpliPrep?上提取核酸后手工轉(zhuǎn)移到COBAS?TaqMan?系統(tǒng)進(jìn)行全自動PCR反應(yīng)體系制備及病毒載量檢測。4、HIV分離株擴增。取10ng病毒株感染5×106經(jīng)PHA刺激后的健康人PBMC2.5h，加D10培養(yǎng)液調(diào)整濃度至1×106/ml，置于37℃，95%濕度，5%CO2培養(yǎng)箱。每2天收集培養(yǎng)上清并補充培養(yǎng)基，每周補充PHA刺激后健康人