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《單味中藥骨碎補(bǔ)對兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、遼寧中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文單味中藥骨碎補(bǔ)對兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究姓名：金連峰申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：中西醫(yī)結(jié)合臨床指導(dǎo)教師：劉元祿20090401遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2006屆博士學(xué)位論文摘要目的：骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)，是由于多種因素引起的多發(fā)于老年人的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，60歲以上的人群中，50％人群在X線上有骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，其中35％-50％有臨床表現(xiàn)；75歲以上的人群中，80％有骨性關(guān)節(jié)炎癥狀。隨著人口老齡化的進(jìn)展，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐年上升，發(fā)病年齡也有下降趨勢，有資
2、料報道45歲以上人群骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率超過40％。隨著我國步入老齡化人口社會，骨關(guān)節(jié)炎正日漸成為醫(yī)患共同關(guān)注的焦點(diǎn)，為此世界衛(wèi)生組織(WHO)將lO月12日定為“世界骨關(guān)節(jié)炎日"，21世紀(jì)頭十年為“骨關(guān)節(jié)病十年"。骨性關(guān)節(jié)炎是膝關(guān)節(jié)炎癥中最常見的疾病。膝骨性關(guān)節(jié)炎在老年人群中最為常見，尤其是在肥胖的老年人群。男女均可發(fā)病，女性多于男性。臨床觀察證實(shí)，膝骨性關(guān)節(jié)炎患者已普遍擴(kuò)展到35歲以上人群，嚴(yán)重困擾著人們的日常生活與勞動。骨性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性和丟失及關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨骨質(zhì)再生為特征的慢性關(guān)節(jié)炎疾病。
3、該病的始發(fā)部位在軟骨。骨關(guān)節(jié)炎的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，一般認(rèn)為既有年齡、性別、家族易感性等全身因素的參與，又有局部生物力學(xué)、軟骨細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子和降解酶等的作用，是多因素、多環(huán)節(jié)導(dǎo)致的疾病。有文獻(xiàn)報道，軟骨細(xì)胞凋亡可能是oA發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。目前，軟骨細(xì)胞凋亡信號的誘導(dǎo)途徑(Fax、NO)，調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡的信號因子(Bcl-2家族，caspases蛋白酶)，軟骨細(xì)胞凋亡的刺激信號等指標(biāo)是實(shí)驗(yàn)研究中的熱點(diǎn)。大量研究也證實(shí)，oA病程中自介素1(IL-I)、腫瘤壞死因子一Q(TNF-Q)、基質(zhì)金屬蛋白
4、酶系(MMPs)[尤其是刪P一1、砌IP-3、MMP-13和金屬蛋白酶組織抑制劑一1(TIMP-I)]等顯著變化。通過這些指標(biāo)的測定可以間接了解oA的演進(jìn)過程，推測它們在oA發(fā)病機(jī)制中對軟骨細(xì)胞凋亡所起的作用，還有是用于評價0A干預(yù)措施的作用靶點(diǎn)與機(jī)理。骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)學(xué)中屬于“痹病"，“骨痹"范疇，肝腎不足，筋骨失養(yǎng)是重要發(fā)病機(jī)制。骨碎補(bǔ)性味苦、溫，活血續(xù)傷，補(bǔ)腎強(qiáng)骨，為骨傷科要藥，具有一定的改善軟骨細(xì)胞功能，推遲軟骨細(xì)胞退行性變的作用。本實(shí)驗(yàn)主要利用細(xì)胞、分子生物學(xué)技術(shù)，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR
5、)、蛋白印跡(Western—blot)等檢測方法，通過軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的不同表達(dá)，進(jìn)一步探討oA發(fā)病機(jī)制，研究骨碎補(bǔ)作用機(jī)理，觀察其對實(shí)驗(yàn)性兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡單味中藥骨碎補(bǔ)對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究的影響，并進(jìn)行了理論分析，為中醫(yī)藥防治膝骨性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)與臨床提供理論與實(shí)際應(yīng)用的依據(jù)。材料與方法：1、實(shí)驗(yàn)動物成年新西蘭大耳白兔24只，普通級，雌雄不分，重量2-3kg。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。2、實(shí)驗(yàn)藥物2．1骨碎補(bǔ)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。水煎濃縮成含生藥濃度lg／
6、ml的藥液備用，共計630mi。2．2維固力愛爾蘭RottapharmLtd，批號：H20040637，規(guī)格：0．259(以硫酸氨基葡萄糖計)，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。3、實(shí)驗(yàn)主要試劑(1)WesternBlot檢測用I抗抗體：鼠抗兔單克隆抗體IL一1、羊抗兔TNF—Q、鼠抗兔MMP3、鼠抗兔Bcl一2、羊抗兔BAX、鼠抗兔Caspase一3、羊抗兔B—actin(美國santacruzbiotechnology，@inc．)。II抗抗體：堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗鼠、兔抗羊抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)
7、。(2)內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑：3％過氧化氫溶液(3)封閉用正常小牛血清白蛋白工作液(4)堿性磷酸酶標(biāo)記的II抗工作液(5)濃縮PBS緩沖溶液(6)3，3一氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(3，3-Diaminobenxidinetetrahydroehloride，DAB)(2)一(6)福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司(7)總RNA提取試劑異硫氰酸胍(TriozolReagent)：美國InvitrogenLifetechnologies公司(8)反轉(zhuǎn)錄酶(AMY)(9)RNA酶抑制劑(10)dNTP混合液(11)Oligo(d
8、T)15(12)Y—TaqDNA聚合酶遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2006屆博士學(xué)位論文(13)目的基因引物(8)一(13)日本TaKaRa公司(14)瓊脂糖：美國Promaga公司(15)考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒：南京建成生物工程公司(16)硝酸纖維素膜：購自Millopore公司(17)其他試劑：6×凝膠上樣緩沖液、DNA電泳緩沖液(TBE)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(
