永生化髁突軟骨細胞軟骨表型的特征

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1、萬方數(shù)據(jù)旦壁塑亙鹽整壁查!!Q!生蔓l!鲞墨l塑永生化髁突軟骨細胞軟骨表型的特征STUDYOFTHECHONDROCYTEPHENOTYPEOFIMMORTALIZEDMANDIBULARCoNDYLARCHONDROCYTE段小紅，吳軍正，劉斌中圖分類號：R78文獻標識碼：B文章墉號：1005—4979{2002)01．071．03體外培養(yǎng)的髁突軟骨細胞(mandibularcond)，larchondrocyte，MCC)常表現(xiàn)出不同分化狀態(tài)的軟骨細胞并存，其表型特征也隨培養(yǎng)時間而變化，這些不穩(wěn)定的因素為研究MCC的生物學(xué)特性帶來了一定的困難。作者通過基因轉(zhuǎn)染的方法將SV4

2、0大T抗原基因?qū)朐囵B(yǎng)的兔髁突軟骨細胞，建立了能在體外1年半的時間內(nèi)穩(wěn)定傳代100次以上的永生化髁突軟骨細胞系?(immortalizedmandibularcondylarchondrocyte，IMCC)。一些實驗表明，永生化的軟骨細胞失去了軟骨細胞的表型特征，本實驗將通過免疫組化方法，觀察IMCC有無Ⅱ型膠原和軟骨特異的蛋白多糖(proteoglycan，PG)的表達。l材料與方法1．11MCC的建系過程1構(gòu)建含有SV40大T抗原基因片段的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將目的基因轉(zhuǎn)入包裝細胞PA317，利用G418篩選陽性克隆，收集并過濾陽性克隆的病毒上清

3、。采用膠原酶和胰蛋白酶消化法原代培養(yǎng)1—2周的新西蘭白兔的MCC，通過差異貼壁獲得純化的MCC。用高滴度的病毒上清感染MCC，G418篩選3周后有克隆出現(xiàn)，用濾紙法和有限稀釋法挑選克隆，并擴大培養(yǎng)，進行常規(guī)的凍存、復(fù)蘇、傳代、以及有關(guān)的生物學(xué)鑒定。1．2免疫組化檢測取第40代和第60代的IMCC以及第3代的MCC作為實驗對象?？贵w分別是：小鼠抗人I型膠原單克隆抗體(Sigma)、小鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體(NewMarkers)、兔抗牛Ⅱ型膠原多克隆抗體(Chemicon．USA)，小鼠抗兔軟骨特異性PG單抗(Chemicon，USA)，免疫組化試劑盒采用Vector公司的免疫

4、組化ABC試劑盒：常規(guī)細胞爬片，當(dāng)細胞長至約80％時，終止培71養(yǎng)。PBS洗2次，丙酮：甲醇(70：30)固定1h；3％H202室溫封閉10min，PBS洗2次；10％小牛血清封閉30—60min；1抗(三種抗體效價為l：loo～1：200)40c孵育過夜，同時以PBS替代1抗．作為對照；PBS洗3次，每次10min；生物素標記馬抗鼠或馬抗兔IgG37℃30min；PBS洗3次，每次10min；ABC復(fù)合物37℃30min；PBS洗3次，每次10min；DAB顯色5min左右。2結(jié)果本實驗所用的I型膠原抗體可以識別人、兔、大鼠等的I型膠原蛋白，結(jié)果表明IMCCp40和p60，以

5、及MCCp3的細胞胞漿有陽性染色．但MCCp3的陽性細胞較少(見圖1)。由于沒有合適的抗兔Ⅱ型膠原抗體，所以本實驗嘗試用抗人和抗牛的Ⅱ型膠原抗體．實驗發(fā)現(xiàn)，兩種細胞在胞漿和胞膜都有陽性染色(見圖2)，但使用抗人Ⅱ型膠原抗體的染色結(jié)果較差，染色灰度較弱。本實驗使用的小鼠抗兔軟骨蛋白多糖單克隆抗體，可以特異識別人、牛、兔、狗等種類的關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖的核心蛋白的短肽，IMCCp40和p60，以及MCCp3的細胞胞漿和胞膜都有陽性染色(見圖3)。3討論Ⅱ型膠原是軟骨細胞分泌的特異性物質(zhì)之一，本實驗證明，IMCC和MCC同時都有抗Ⅱ型膠原的陽性染色，表明這兩種細胞具有軟骨表型。軟骨特異P

6、G的表達也再次證明了這一點：并且不同代數(shù)的IMCC持續(xù)表達Ⅱ型膠原和PG說明該細胞系具有穩(wěn)定的軟骨細胞表型。作者單位：第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院(710032，作者簡介：段小紅(1968)，女，江蘇』、．現(xiàn)為西安交通大學(xué)材料學(xué)院在讀博士后萬方數(shù)據(jù)正常成熟的軟骨細胞不合成I型膠原，體外單層培養(yǎng)軟骨細胞初期，細胞繼續(xù)臺成Ⅱ型膠麒，但傳代到4代以后，細胞的形態(tài)一方面從多角形或圓形轉(zhuǎn)變成梭形，另一方面，n型膠原的合成減少，I型膠原的表達增多2·3。與從肋骨或關(guān)節(jié)軟骨提取的軟骨細胞不同．MCC體外培養(yǎng)的細胞群體不是單一的，包括未分化的間質(zhì)細胞、幼稚和成熟的軟骨細胞、及肥大化的軟骨細胞4-“，

7、因此可能有表達Ⅱ型口腔頜面外科雜忐2002年第12卷第1期膠原的成熟的軟骨細胞，也有表達I型膠原的幼稚軟骨細胞和未分化的軟骨細胞，所以有J型膠原和Ⅱ型膠原的同時表達。一些實驗表明，大T抗原iJ以引起軟骨細胞的永生化，使細胞小再表達Ⅱ型膠原，H表達l型膠原，并且這種變化不能逆轉(zhuǎn)，如Thenet、Bhalerao_^7等的實驗結(jié)果、但也有不同的報道，文獻報道，利用大T抗原的基因片段獲得了具有軟骨表型的永生萬方數(shù)據(jù)旦墅塑墮叢壁盤查!鯉!生蔓!!鲞筻!塑化細胞株MC615。SV40引起軟骨細胞永生化