壩上長尾雞資源保護及羽色多樣性分子遺傳基礎(chǔ)

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1、博士學(xué)位（畢業(yè)）論文壩上長尾雞資源保護及羽色多樣性分子遺傳基礎(chǔ)學(xué)位申請人：劉小輝指導(dǎo)教師：李祥龍教授周榮艷副教授學(xué)科專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)博士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二〇一八年五月二十八日分類號：S831.2單位代碼：10086密級：公開學(xué)號：20151140040壩上長尾雞資源保護及羽色多樣性分子遺傳基礎(chǔ)ResourcesProtectionandMolecularGeneticBasisofPlumageColorDiversityofBashangLong-tailChickens學(xué)位申請人：劉小輝指導(dǎo)教師：李祥龍教授周榮

2、艷副教授學(xué)科專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)博士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二〇一八年五月二十八日摘要壩上長尾雞是壩上人民經(jīng)長期選育的蛋肉兼用型地方品種，具有野外覓食力強，耐粗飼，抗病力強，肉嫩味美等特點。但壩上地區(qū)處于農(nóng)戶自繁自養(yǎng)狀態(tài)，人們保種意識較弱，很多外來品種使得壩上長尾雞受到雜化，本研究開始時處于瀕危狀態(tài)，因此急需建立保種場和保種群進行保護。壩上長尾雞羽色豐富，包括白、黑、麻、蘆花、銀灰和山水羽，是研究羽色遺傳多樣性，初步研究其分子遺傳基礎(chǔ)的良好素材。本研究以壩上長尾雞毛囊組織為材料進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，篩選與羽色形成相關(guān)的候選基因

3、，并通過聚類、GO、KEGG對差異表達基因進行分析；為探明雞EDNRB2、MITF、PMEL和TYR基因啟動子活性區(qū)及其結(jié)構(gòu)，構(gòu)建雙熒光素酶表達載體，通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞（DF1），利用雙熒光素酶檢測試劑盒進行啟動子活性檢測。本研究的主要結(jié)果如下：1.建立了壩上長尾雞保種核心群和基礎(chǔ)群。其外型特征、生長性能、繁殖性能均符合品種特征。獲得了體重生長發(fā)育的擬合模型，公雞體重生長Gompertz模型為Y=2015.524e-4.218exp(-0.146t)，母雞體重生長Gompertz模型為Y=1396.131e-3.849exp(-0.155

4、t)。壩上長尾雞開產(chǎn)日齡165天，開產(chǎn)蛋重39.69g，標(biāo)準(zhǔn)蛋重47g，種蛋孵化率最高的蛋重和蛋形指數(shù)分別為44.6~54.5g和1.35~1.44。產(chǎn)蛋曲線的VonBertalanffy擬合模型為Y=111.849(1-7.257e-0.103t)3。2.本研究基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，每種羽色文庫產(chǎn)生2500萬以上成對的過濾后的reads，占總reads數(shù)的96.73%到96.98%。所有的reads中比對到基因組的大于78%，比對到外顯子的約70%。篩選出羽色相關(guān)候選基因GPNMB、PMEL、TYRP1、GPR143、OCA2、SOX10、SLC

5、45A2、KRT75、TYR、EDNRB2、SLC24A5、RAB38和ASIP。差異表達基因聚類分析表明麻羽和山水羽先聚為一類，再與銀灰、蘆花羽聚為一類，最后與黑羽和白羽聚為一類。羽色黑色區(qū)域大小以及羽色深淺可能和GPNMB、PMEL、TYRP1、GPR143、OCA2、SOX10、SLC45A2、SLC24A5、KRT75、TYR的表達水平相關(guān)。壩上長尾雞TYR基因純合子突變和低表達引起白羽表型。差異表達基因的GO分析主要富集到細胞骨架和細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的terms，KEGG主要富集到黑素原生成、酪氨酸代謝及核黃素代謝通路。3.成功克隆了壩上長尾雞ED

6、NRB2、MITF、PMEL、TYR基因5'側(cè)翼區(qū)片段分別為1616bp、1385bp、1268bp、1813bp，構(gòu)建了含有不同長度啟動子片段的表達載體（E1~E8、M1~M6、P1~P9、T1~T7）及啟動子區(qū)突變載體（mut-E-1~mut-E-3、mut-M-1~mut-M-4、mut-P-1、mut-T-1和mut-T-2），核心啟動子區(qū)分別為-814~+59、-660~+200、-840~+68、-810~+65，預(yù)測到多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。其中-814~-105為EDNRB2基因正調(diào)控區(qū)；-840~-590和-525~-266為PMEL基

7、因正調(diào)控區(qū)，-590~-525為PMEL基因負調(diào)控區(qū)；-810~-213為TYR基因正調(diào)控區(qū)。通過測序的方法篩選出啟動子區(qū)多態(tài)位點分別為13、10、12和6個，黑、麻、蘆花羽雞EDNRB2多態(tài)位點（-631、-615、-600、-577、-513、-397、-392和-340）基因型及等位基因頻率差異顯著（P<0.05），MITF多態(tài)位點（-579、-505、-274、-220、-203~-202、-98、-46、-14、+1和+28）對啟動子活性有較大影響。PMEL多態(tài)位點（-456、-435、-410、-374和-341）對啟動子活性有較大影響。P

8、MEL基因-1152~-483bp和-150~+12bp處分別存在670和162bp的CpG島