熒光定量pcr在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

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1、熒光定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用內(nèi)容提要一、基因診斷技術(shù)簡(jiǎn)介二、乙型肝炎的病原檢測(cè)三、丙型肝炎的病原檢測(cè)四、性病相關(guān)病原體的檢測(cè)基因診斷技術(shù)簡(jiǎn)介4基因診斷3免疫學(xué)診斷臨床診斷細(xì)胞膜細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)1形態(tài)學(xué)診斷2生化診斷概念PCR與基因診斷技術(shù)基因診斷即通過(guò)核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)直接檢測(cè)基因的存在狀態(tài)或缺陷對(duì)疾病作出診斷的方法。Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)通過(guò)兩個(gè)短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶的作用，可

2、在3個(gè)小時(shí)內(nèi)把特定的DNA片段擴(kuò)增1000萬(wàn)倍。九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國(guó)內(nèi)全面開展，1998年，熒光定量PCR技術(shù)開始在中國(guó)應(yīng)用于臨床檢測(cè)。熒光定量PCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對(duì)已知基因序列的核酸測(cè)定中最靈敏的方法。熒光染料：SYBRGreenI、EVAGreen熒光探針：TaqMan、HybridizationProbes、Molecul

3、arBeacon熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)：直接擴(kuò)增病原體的特異DNA或異?；蚱戊`敏度高：可檢測(cè)到極少量的DNA，有效降低漏診率高效省時(shí)：擴(kuò)增周期短，有利于快速診斷取材范圍廣：血清、痰液、體液、毛發(fā)等多種樣本全封閉反應(yīng)：無(wú)需PCR后處理，降低污染定量準(zhǔn)確：利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，采用對(duì)數(shù)期分析自動(dòng)化程度高：操作安全，避免人為判斷RocheLightCycler熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測(cè)性病相關(guān)病原體（CT、NG、UU、HPV）的基因檢測(cè)優(yōu)生優(yōu)育項(xiàng)目

4、診斷：人巨細(xì)胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒II型（HSV）、弓形蟲（TOX）、風(fēng)疹病毒其它病原體檢測(cè)：結(jié)核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等乙型肝炎的病原檢測(cè)乙肝病毒HBV的感染過(guò)程乙肝如何傳染？慢性HBV感染病毒持續(xù)6個(gè)月未被清除者免疫耐受期：HBV復(fù)制活躍免疫清除期非活動(dòng)或低復(fù)制期慢性乙型肝炎HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎HBeAg陰性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化代償期肝硬化失代償期肝硬化HBsAg與抗HBsHBsAg在感染HBV兩周后即可陽(yáng)性。只要HBsAg陽(yáng)性就可診斷HBV感染，陰性則

5、不能排除HBV感染?？笻Bs為保護(hù)性抗體，陽(yáng)性表示對(duì)HBV有免疫力。HBsAg和抗HBs同時(shí)陰性：即所謂窗口期，此時(shí)HBsAg和抗HBs都未產(chǎn)生。HBsAg和抗HBs同時(shí)陽(yáng)性：HBV感染恢復(fù)期，此時(shí)HBsAg未消失，抗HBs已產(chǎn)生。或者是亞型感染。為什么HBsAg陰性不能排除HBV感染？窗口期檢測(cè)試劑不夠靈敏隱匿性慢性乙肝（S基因變異）重疊HCV感染（干擾HBsAg合成）抗HBs陽(yáng)性就萬(wàn)無(wú)一失了嗎？單一抗HBs陽(yáng)性HBVDNA檢出率0-11.8%先后感染了不同的HBV亞型HBV病毒S基因變異如何診斷血清HB

6、sAg陰性的HBV感染？提高檢測(cè)敏感性采用針對(duì)變異抗原的檢測(cè)試劑HBVDNA的檢測(cè)！HBeAg與抗HBeHBeAg的存在表示病毒復(fù)制活躍且有較強(qiáng)的傳染性。HBeAg消失而抗HBe產(chǎn)生稱為血清轉(zhuǎn)換?？笻Be陽(yáng)轉(zhuǎn)后，病毒復(fù)制水平低，傳染性降低。但長(zhǎng)期抗HBe陽(yáng)性者并不代表病毒復(fù)制停止或無(wú)傳染性，研究顯示20%～50%仍可檢測(cè)到HBVDNA，部分可能由于前C區(qū)基因變異，導(dǎo)致不能形成HBeAg。HBeAg與抗HBe共存？處于血清轉(zhuǎn)換過(guò)程中野生株與變異株同時(shí)存在HBeAg水平與HBVDNA的關(guān)系HBeAg陽(yáng)性標(biāo)本HB

7、VDNA檢出率90％左右HBeAg與HBVDNA有著良好的相關(guān)性HBeAg陰性/抗HBe陽(yáng)性/HBVDNA陽(yáng)性HBVDNA水平一般較低HBV低水平復(fù)制HBV病毒前C區(qū)基因變異重疊HCV感染“兩對(duì)半”缺陷“兩對(duì)半”是機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài)，為間接指標(biāo)?！皵y帶者”、“大三陽(yáng)”、“小三陽(yáng)”等免疫學(xué)指標(biāo)不能反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。HBsAg陰性或HBeAg陰性不能排除HBV感染。HBVDNA是病毒復(fù)制和傳染性的直接標(biāo)志。HBVDNA定量對(duì)于判斷病毒復(fù)制程度、傳染性大小、病毒藥物療效等有重要意義。HBVDNA拷貝

8、數(shù)＝乙肝病毒載量HBVDNA檢測(cè)的臨床意義HBVDNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBVDNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志HBVDNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBVDNA對(duì)乙肝兩對(duì)半起補(bǔ)充作用HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)HBVDNA可檢測(cè)出隱匿性慢性乙型肝炎提供直接證據(jù)縮短“窗口期”PCR檢測(cè)“窗口期”核酸檢測(cè)縮短的“窗口期”的天數(shù)HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于獻(xiàn)血員窗口