醫(yī)學(xué)課件基因診斷_1

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1、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)MedicalMolecularBiologyChapterⅡ基因診斷GeneDiagnosis基因診斷概念（genediagnosis)通過(guò)對(duì)基因或基因組進(jìn)行直接分析而診斷疾病的方法。（DNA或RNA水平）基因診斷建立在分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上：20世紀(jì)70年代，核酸分子雜交技術(shù)。20世紀(jì)80年代，PCR技術(shù)20世紀(jì)90年代，基因芯片(genechip)1為什么需要建立基因診斷方法？目前常用的診斷方法有一定局限性。物理診斷：望、叩、觸、聽(tīng)等，生化、免疫學(xué)、病理學(xué)、影像學(xué)檢查等。共同特點(diǎn)：針對(duì)疾病的表型改變建立診斷指標(biāo)。對(duì)于多數(shù)非感染性疾病而言，引起疾

2、病發(fā)生的根本原因是基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)異常；感染性疾病的發(fā)生則是由于病原體侵入體內(nèi)，表達(dá)外源基因所致?；蚣盎虮磉_(dá)異常將導(dǎo)致疾病疾病幾乎所有的疾病都與基因改變有關(guān)基因診斷不僅可以在表型改變前進(jìn)行早期診斷，更是對(duì)疾病進(jìn)行本質(zhì)進(jìn)行診斷。基因診斷結(jié)果還能提示疾病發(fā)生機(jī)制。2基因診斷的特點(diǎn)直接以病理基因（致病基因、疾病基因和外源性病源生物基因）為分析對(duì)象。可確定病源生物基因是否存在，或分析疾病相關(guān)的體內(nèi)基因缺失或基因突變。以DNA或RNA為材料，是分子水平上的診斷。特異性強(qiáng)，靈敏度高。逆向診斷（reversediagnosis）:和傳統(tǒng)的診斷方法主要差異在于直接從基因型推斷表型，

3、即可以越過(guò)產(chǎn)物（酶和蛋白質(zhì)）直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)而作出診斷，這樣就改變了傳統(tǒng)的表型診斷方式，故基因診斷又稱為逆向診斷（reversediagnosis）。有預(yù)測(cè)作用：可揭示尚未出現(xiàn)癥狀時(shí)與疾病相關(guān)的基因狀態(tài)，對(duì)表型正常的攜帶者及某種疾病的易感者作出診斷和預(yù)測(cè)。對(duì)有遺傳疾病家族史的個(gè)體或產(chǎn)前的胎兒是否攜帶致病基因的檢測(cè)具有指導(dǎo)意義。3目前臨床上基因診斷用于哪些疾?。窟z傳病異常血紅蛋白病、α地貧、β地貧杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchennemusculardystrophy,DMD)笨丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)脆性X綜合征腫瘤白血病的診斷和分型（利用融合基

4、因）鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤（檢測(cè)EB病毒）子宮頸癌（檢測(cè)人類乳頭瘤病毒HPV)肝癌（檢測(cè)乙型肝炎病毒HBV)(檢測(cè)丙型肝炎病毒HCV)成人T細(xì)胞性白血病淋巴瘤HTLV-1病毒感染性疾病病毒感染性疾?。阂倚透窝祝℉BV)；嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）細(xì)菌感染性疾?。杭?xì)菌性痢疾（痢疾桿菌、大腸桿菌）結(jié)核?。ńY(jié)核分枝桿菌）寄生蟲(chóng)感染性疾病：如瘧原蟲(chóng)感染基因診斷的樣本獲取便利，一般不受組織或時(shí)相限制，包括：外周血白細(xì)胞、口腔粘膜細(xì)胞活檢標(biāo)本、發(fā)根、石臘包埋的組織塊沉淀細(xì)胞（唾液、痰液、尿液）羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞、胚胎植入前細(xì)胞進(jìn)入母體循環(huán)的胎兒細(xì)胞應(yīng)用PCR，樣本可微量

5、化到一個(gè)細(xì)胞二、基因診斷方法（一）基因診斷的常用技術(shù)1.核酸分子雜交技術(shù)：用于檢測(cè)樣品中是否存在相應(yīng)的基因或相應(yīng)基因的表達(dá)狀態(tài)。（1）Southern雜交：用于分析基因組中特定基因的結(jié)構(gòu)和定量（2）Northern雜交：檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平和長(zhǎng)度分析（3）斑點(diǎn)雜交：用于檢測(cè)細(xì)胞中基因拷貝數(shù)的變化或mRNA含量變化。簡(jiǎn)便，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。（4）原位雜交：用于組織和細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA定性或精確定位分析（5）等位基因特異性寡核苷酸雜交法（ASOH)：根據(jù)已知基因突變位點(diǎn)的堿基序列，設(shè)計(jì)和制備與野生型或突變型基因序列互補(bǔ)的兩種探針，分別與被檢者的DNA雜交，根據(jù)樣品與兩種探

6、針結(jié)合信號(hào)的強(qiáng)弱，可檢測(cè)出：被檢者是否存在基因突變以及被檢者是該突變基因的純合子或雜合子異常探針TAG正常人患者DNADNA點(diǎn)雜交正常探針GAG正常人患者DNADNA點(diǎn)雜交純合突變正常CTC異常CTA點(diǎn)突變基因2.限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性*由于堿基變異可能導(dǎo)致限制酶切點(diǎn)消失或新的酶切點(diǎn)出現(xiàn)，引起不同個(gè)體DNA在用同一限制酶切割時(shí)，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段，稱RFLP*RFLP按孟德?tīng)枺ü诧@性）方式遺傳，是非常有用的遺傳標(biāo)記。RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLPRFLP進(jìn)行基因診斷的基本步驟AlleleII產(chǎn)生了新的酶切

7、點(diǎn)AlleleIAlleleII12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8KbRFLP—Southernblot檢測(cè)結(jié)果AlleleII酶切位點(diǎn)消失AlleleIAlleleII12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)，對(duì)樣本質(zhì)量要求不高，能快速、特異地?cái)U(kuò)增任何DNA片斷。PCR缺點(diǎn)由于高靈敏度，使易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。該技術(shù)已成為基因診斷的主要和首選技術(shù)。PCR相關(guān)技術(shù)名稱用途SSP－PCR等位基因分型和突變分析RT-P