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《植物材料的培養(yǎng)及組培及農(nóng)桿菌侵染》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、三、感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化熱激感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)試劑CCMB80：KAc10ml(use1Mstock,pH9)，CaCl2*2H2O11.8g，甘油100ml，定容至1L用時(shí)每98mlCCMB80加入1mlMnCl2*4H2O(2M)和1mlMgCl2*6H2O(1M)HCl調(diào)節(jié)pH6.4實(shí)驗(yàn)步驟1）劃平板活化菌種（DH5α），挑單菌落37°C搖小管過夜，轉(zhuǎn)大瓶,待OD600=0.6～0.7將裝菌的大瓶置于冰上15分鐘。2）750-1000g(2000-3000rpm)離心12-15分鐘，棄上清。必要時(shí)可用吸濾
2、器吸干。3）加入離心下來細(xì)菌體積的1/3的CCMB80，輕柔的將菌搖散。置于冰上20分鐘。4）重復(fù)步驟2。5）用原來大瓶菌液體積的1/12.5CCMB80,輕柔的將菌搖散。置于冰上15分鐘。6）分裝，每管100μl，管子需-70預(yù)冷。7）速凍，-70°C存放。電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備方法一、實(shí)驗(yàn)試劑重蒸水，10%甘油，20%甘油實(shí)驗(yàn)步驟1）同熱擊感受態(tài)步驟1，用X-L1Blue菌種。2）5000rpm離心,20分鐘，小心倒去上清，加入少量重蒸水,輕柔的將菌搖散。將離心管加滿水，混勻，離心(5000rpm)。3）同步驟2
3、，洗2次。4）同步驟2用10%甘油洗一次。5）棄上清后，用與細(xì)菌體積相同的20%甘油將細(xì)菌均勻分散，分裝到預(yù)冷的500ul離心管中，每管50μl。6）速凍，-70度存放。方法二、（以50ml菌為例）試劑1MCaCl2（14.7gCaCl2溶于100mlH2O），分裝成1.2ml/管。使用時(shí)稀釋成0.1MCaCl2（1.2ml稀釋成12ml）步驟：（50ml菌）1．劃平板活化菌種，挑單菌落37℃搖小管2ml過夜，1：100放大（0.5ml菌→50ml菌），待OD600=0.3-0.4，將裝菌的瓶子置于冰上10-30m
4、in。同時(shí)冰上預(yù)冷0.1MCaCl2，冷凍離心機(jī)4℃預(yù)冷。2．3000rpm離心10分鐘，迅速棄盡上清。3．用10mlCaCl2輕柔的于冰上將菌搖散。置于冰上30分鐘。4．2500rpm離心10分鐘，迅速棄盡上清。5．用2mlCaCl2輕柔的于冰上將菌搖散。每管200μl，管子需預(yù)冷6．置于冰上2hr-48hr內(nèi)使用熱擊冰上30min，42℃90sec，并上10min。加入200μlLB37℃復(fù)蘇2hr。農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（電擊）1）接種小養(yǎng)（eg.3ML）28℃培養(yǎng)過夜。2）1:100放大培養(yǎng)（eg。300M
5、LYEB中）至OD=0.5。3）icechilled??5000rpm10min(冷凍離心機(jī),預(yù)冷到4℃)。4）Washedby1mMHEPES(PH7.0)3次(每次10ML)。5）10%甘油洗一次。6）溶于3ML10%甘油中,40ｕL每管于-70℃保存。備注:離心管,dorf管,HEPES,甘油均須冰上預(yù)冷,所有的操作以在冰上進(jìn)行為好.另：農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)細(xì)胞還可按大腸桿菌電擊感受態(tài)細(xì)胞同樣的制作。農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1)調(diào)節(jié)電擊儀,使其電脈沖為25ｕF,電壓為2.5KV,電阻為400Ω。2)從-70℃冰箱中取出
6、電擊感受態(tài)細(xì)胞（EHA105）,置于冰上使其融化。3)加1ｕL質(zhì)粒于感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻。4)將上述菌液和DNA懸液加進(jìn)電擊杯的底部，迅速將電擊杯放進(jìn)電擊儀。5)按設(shè)定的參數(shù),啟動(dòng)對(duì)細(xì)胞的電脈沖。6)電擊以后，盡快取出樣品，加入1ML無抗YEB培養(yǎng)基。7)將上述菌液轉(zhuǎn)入1.5MLdorf管中，28℃2小時(shí)以上。8)將菌液涂布在加有相應(yīng)抗生素的YEB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2-3天，直至菌落長出。備注:所有操作最好在冰上進(jìn)行；電擊杯電擊之前在冰上預(yù)冷；電擊杯中要除去氣泡。農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（熱擊）1)從YEB和YE
7、P培養(yǎng)基平板上分別挑取單菌落，接種于含有3ml液體培養(yǎng)基的試管中，28℃振蕩培養(yǎng)16~18h。2)從試管中取出200μl菌液接種于含20ml相應(yīng)液體培養(yǎng)基中（100倍稀釋），培養(yǎng)4~6h至對(duì)數(shù)生長期。取1.5ml菌液加入到1.5ml的無菌離心管中，4℃，3000rpm離心5min，棄上清。沉淀用800μl的預(yù)冷TE溶液（10mMTris-HClpH7.5；1mMEDTApH7.5）洗一次，4℃，3000rpm離心5min，棄上清。3)沉淀用800μl的YEB（YEP）培養(yǎng)基重新懸浮，然后按每管200μl分裝到1.5
8、ml的無菌離心管中，液氮速凍后于-70℃保存?zhèn)溆?。農(nóng)桿菌熱擊轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1)轉(zhuǎn)化前將保存的感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。2)加入0.5~1μg質(zhì)粒DNA，同時(shí)以無菌水代替DNA作為對(duì)照，冰上放置5min。3)液氮中速凍5min。1)取出后立即于37℃保溫5min。2)每管中加入800μlYEB液體培養(yǎng)基，28℃恒溫?fù)u床緩慢振蕩2~4h。3)取200μl菌液涂于YEB（含
