生物樣品前處理方法ppt課件

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1、生物樣品前處理方法content生物樣品處理目的前處理過程及方法分析方法的限度要求生物樣品的種類血樣根據(jù)藥物具體性質(zhì)選擇血清（serum)全血（wholeblood）血漿（plasma)置含有抗凝劑的試管中，2500～3000rpm離心5～10min，淡黃色上清液，約為全血的50-60%?藥物動力學(xué)，生物利用度，臨床治療藥物濃度監(jiān)測置試管中，于37℃或室溫放置30min～1h，血液凝固后，剝?nèi)ピ嚬鼙谏系难灒?500～3000rpm離心5～10min，淡黃色液體，約為全血20-40%血清的獲取量小，但

2、血清成分更接近于組織液的化學(xué)成分，測定血清中有關(guān)物質(zhì)的含量，比全血更能反映機體的具體情況加入抗凝劑混合，防止凝血后影響測定對于與紅細胞結(jié)合的藥物，以及血漿濃度低或藥物在血漿與紅細胞分配比不恒定的情況下應(yīng)用一.生物樣品的種類唾液（saliva）尿液(urine)一般采集時間尿（規(guī)定時間內(nèi)采集尿液體積和排入尿中的藥物總量）藥物濃度高，但變化體內(nèi)藥物清除以原形、I相及II相代謝物等多種形式通過尿液排出排出預(yù)測藥物代謝過程、類型,計算藥物尿清除率、生物利用度的研究。在漱口后15min，安靜狀態(tài)下采集口腔內(nèi)自然

3、流出的唾液；也可在刺激下快速采樣，石蠟片，聚四氟乙烯塊，紗布球，檸檬酸，維生素C等置于舌尖，棄取初始部分后采集血漿游離藥物濃度（P）密切相關(guān)，可使用唾液樣品CS/CP比值較恒定時，可代替血樣進行TDM及藥代動力學(xué)研究頭發(fā)組織：腦、心、肝、脾、肺、腎、胃等目的去除生物樣品中的大分子雜質(zhì)，滿足測定方法對分析樣品的要求保護儀器性能，改善分析條件分離并富集所要測定的成分藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放－測定藥物的總濃度二.生物樣品處理的目的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)內(nèi)源性酸內(nèi)源性酸內(nèi)源性酸藥藥藥藥生物樣品藥2.綴合物

4、水解3.提取、富集1.去除蛋白質(zhì)3.衍生化4.衍生化加入強酸超濾法加入中性鹽加熱法酶水解法溶劑解法加入重金屬鹽三.前處理過程及方法1.1-溶劑解法原理：使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚。常用有機溶劑：乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃試劑用量：溶劑體積與血樣比為1～3︰1操作：有機溶劑與血漿或血清按一定比例混合后離心分離，取上清液作為樣品。注意采用超速離心（12000rpm）分離1～2min1.2加入中性鹽原理：中性鹽使蛋白質(zhì)脫水而沉淀常用中性鹽：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽

5、等試劑用量：飽和硫酸銨與血清比例為2︰1操作：血清與中性鹽按一定比例混合后超速離心（10000rpm）分離1～2min，取上清液作為樣品。上清液pH7.0～7.7。1.3加入強酸原理：強酸與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而沉淀。常用：10％三氯醋酸、6％高氯酸、5％偏磷酸等。操作：血清與強酸的比例為1：0.6混合，離心（10000rpm）1～2min，即可。上清液pH0～4，不適于酸性下分解的藥物。過量酸的排除：過量三氯醋酸可通過煮沸或乙醚提取除去；高氯酸、偏磷酸等可用碳酸鉀、醋酸鉀或氫氧化鈉等中和后加乙醇使產(chǎn)生

6、高氯酸鉀（鈉）沉淀被除去。1.4酶水解法測定一些酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢的藥物枯草菌溶素：使組織溶解，使藥物析出。一種細菌性堿性蛋白分解酶，可在較寬的pH活圈（PH7.0～11.0）內(nèi)使蛋白質(zhì)的肽鍵降解，在50～60℃具有最大活力。優(yōu)點：可避兔某些藥物在酸及高溫下降解，對與蛋白質(zhì)結(jié)合牢的藥物（如保泰松、苯妥英納），可顯著改善回收率；可用有機溶劑直接提取酶解液而無乳化現(xiàn)象。不適用于在堿性下易水解的藥物。1.5超濾法性質(zhì)：以多孔性半透膜（超濾膜）作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)。特點：無需加熱；無需添加化學(xué)試劑；

7、無相變化；無破壞性；樣品量少；簡便快捷，結(jié)果穩(wěn)定可靠應(yīng)用：游離藥物首選方法，尤其適合TDM操作：分子量截留值在5萬左右的超濾膜過濾可將分子量大的血漿蛋白以及結(jié)合了藥物的血漿蛋白分離。尿中和有些血中的藥物羥基羧基巰基氨基綴合物葡萄糖醛酸酚羥基芳胺醇類綴合物硫酸2、綴合物的水解由于綴合物較原型藥物具有較大的極性，不易被有機溶劑提取，所以：酸水解?可加入適量的鹽酸液。酶水解?對于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，常用葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶或兩者的混合酶3.分離、純化和濃集3-1.液-液萃取法LLE乳化現(xiàn)象：加固體

8、NaCl；離心；低溫冰箱中快速凍凝對于極性大的藥物：離子對提取法；提取烷基化法有機溶劑(1、2)生物樣品（水溶）(1)藥物內(nèi)源性雜質(zhì)溶解度、沸點低、無毒、與水不溶：乙酸乙酯、乙醚（1.2%水）堿性藥物于堿性；酸性藥物于酸性。酸性；水溶性堿性；親脂性的3-2.固相萃取法SPE原理：不同填料作固定相的微型小柱，當含有藥物的生物樣品溶液通過時，由于受到吸附、分配、離子交換或其它親和力作用，藥物或雜質(zhì)被保留在固定相上，用適當溶劑清洗雜質(zhì)后，再用適當溶劑洗脫藥物。