番茄早疫病對(duì)幾種種農(nóng)藥的抗藥性研究

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1、番茄早疫病對(duì)3種農(nóng)藥的抗藥性研究番茄早疫病菌是番茄重要病害之一。近年來，由于一些地區(qū)推廣抗病毒病而不抗早疫病的番茄品種，導(dǎo)致早疫病嚴(yán)重發(fā)生。發(fā)病時(shí)可引起落葉、落果和斷枝，對(duì)產(chǎn)量影響很大，常年減產(chǎn)20％一30％，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50％以上，甚至絕產(chǎn)。由于番茄早疫病具有潛育期短、再侵染頻繁、流行速率高的特點(diǎn)H1，長(zhǎng)期使用單一藥劑防治，在藥劑的選擇壓力下病原菌容易形成抗藥性群體。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)番茄早疫病抗藥性的研究剛剛開展，這次試驗(yàn)主要測(cè)定其對(duì)嘧菌酯、腐霉利及代森錳鋅3種化學(xué)殺菌劑的敏感性，為其推廣和科學(xué)使用提供了理論依據(jù)。1材料與方法1.1菌種的采集番茄早疫病菌采自于臨安的農(nóng)田

2、及學(xué)校的農(nóng)場(chǎng)基地里德番茄早疫病株果實(shí)或葉片上，按隨機(jī)取樣的原則進(jìn)行。取樣后將所得的各組織分別裝入小袋隔離，帶回后對(duì)其進(jìn)行分離純化。菌株以“采集地點(diǎn)的大寫拼音開頭+序號(hào)”命名。1.2供試藥劑95％嘧菌酯原藥，由浙江東風(fēng)化工有限責(zé)任公司提供；97．8％腐霉利原藥，由南京仁信化工有限公司提供；81．62％代森錳鋅原藥，由浙江東風(fēng)化工提供。1.3菌種的分離與純化1．3．1孢子分離法用經(jīng)過滅菌的接種刀刮取發(fā)病葉背表面霉層，接入PDA(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20．g，水l000m1)平板培養(yǎng)基表面，25℃下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌絲后，用滅菌的接種針挑取早疫菌絲轉(zhuǎn)入另外一個(gè)P

3、DA平板培養(yǎng)基上純化菌種。1．3．2組織分離法將采集到的病葉組織切成3～5mill的方形小塊，在75％乙醇溶液里浸2—3s，然后浸在15％的次氯酸中漂洗3min，最后用無菌水洗滌3～4次。經(jīng)表面消毒的病組織放置在PDA平板培養(yǎng)基，在25℃左右恒溫箱內(nèi)保存，直到產(chǎn)生孢子或菌絲為止(約4～5d)，用滅菌的接種針挑取孢子或菌絲，移到新的PDA平板培養(yǎng)基上。1．3．3單孢分離法將番茄早疫病菌在PDA培養(yǎng)基七培養(yǎng)一周后，注入4℃的無菌水，刮取氣生菌絲，紫外線照射2min，于20一22℃下干燥6h后皿內(nèi)即可產(chǎn)生大量的分生孢子。在培養(yǎng)一周的菌落上用打孔器打下5個(gè)菌碟j放在PDA平

4、板培養(yǎng)基上，用涂抹器涂布均勻。25℃培養(yǎng)24h后對(duì)已萌發(fā)的單個(gè)孢子進(jìn)行標(biāo)記，48h后再把標(biāo)記的單個(gè)菌落移入斜面培養(yǎng)基。1．4病原菌的確定病原菌的鑒定利用赫柯氏法則，將分離出的菌株再接回到番茄葉片上，驗(yàn)證是否為病原菌。從菜園中采集健康的番茄葉片帶回室內(nèi)，用無菌水沖洗，然后在無菌的條件下用75％的酒精浸泡2min并用無菌水換洗5次，最后放到帶濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中。用棉球包裹葉柄的基部．并從各分離菌株菌落的邊緣用接種針挑取直徑4mln的圓形菌落接到葉背面的兩側(cè)，每菌株接3個(gè)菌塊，置于25℃培養(yǎng)。3d后記載發(fā)病情況并觀察病斑子實(shí)體形態(tài)。1．5含藥培養(yǎng)基的制備將95％嘧菌酯原藥

5、溶于甲醇溶液中，配成10000斗s／rnl：母液，代森錳鋅和腐霉利溶于丙酮溶液中，分別配成10000tl，s／ml和5000斗s／ml的母液，都以0．2％的量加入乳化劑Tween80。母液于冰箱4℃貯藏備用，使用時(shí)以無菌水稀釋至適當(dāng)濃度，以10％的藥液量加入熔化的PDA培養(yǎng)基中(冷卻至45—50oC)充分搖勻，制成含最終所需藥量的PDA平板，用以進(jìn)行敏感性測(cè)定及其他試驗(yàn)。1．6敏感基線的建立及敏感性的測(cè)定由于沒有采集到番茄早疫病菌的野生菌株，也未見該病菌對(duì)殺菌劑敏感基線的報(bào)道。浙江省偏遠(yuǎn)山區(qū)建德里中垅從未用過任何殺菌劑，該研究將該地采集分離的菌株所測(cè)得的EC50值作

6、為相對(duì)敏感基線。由于各殺菌劑殺菌作用方式的區(qū)別，對(duì)嘧菌酯敏感性測(cè)定采用孢子萌發(fā)抑制法，對(duì)腐霉利及代森錳鋅的敏感性采用FAO推薦的菌落直徑法一-。從預(yù)培養(yǎng)的番茄早疫病菌同一圓周的菌落上制取邊緣菌碟置于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)10d。用無菌水將培養(yǎng)好的孢子從培養(yǎng)基上洗下，4層紗布過濾，濾液即為孢子懸浮液。濃度調(diào)至5×105個(gè)／ml。在超凈工作臺(tái)上，將嘧菌酯母液與PDA培養(yǎng)基配制成含0．625、0．125、0．025、0．005、0．00l和0ug／ml系列濃度的含藥平板，將制好的孢子懸浮液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，以9mlPDA培養(yǎng)基加1ml無菌水為對(duì)照，重復(fù)3次。放

7、入25℃恒溫培養(yǎng)箱中，暗箱培養(yǎng)。48h后觀察孢子萌發(fā)數(shù)(取3次重復(fù)的平均值)。以藥劑濃度負(fù)對(duì)數(shù)和抑制率機(jī)率值計(jì)算毒力回歸方程Y=a+bX，根據(jù)方程計(jì)算有效抑制中濃度(EC50)和相關(guān)系數(shù)。將被測(cè)菌株在PDA平板上培養(yǎng)72h后，自菌落邊緣打取直徑為4mm的菌碟，在含藥平板上進(jìn)行敏感性測(cè)定，設(shè)置5～8個(gè)梯度濃度，以不加藥者為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。各濃度設(shè)置如下：腐霉利濃度為0、0．1、0．5、1．0、2．0、5．0、6．0、8．0、10．0ug／ml，代森錳鋅濃度為0、l、5、10、20、50、100、200ug／ml。于25℃培養(yǎng)72h后，采用十字交叉法測(cè)定菌落凈