埃博霉素的生物合成與埃博霉素d內(nèi)酰胺衍生物的半合成研究

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1、埃博霉素的生物合成與埃博霉素D內(nèi)酰胺衍生物的半合成研究閻家麒（湖北荊工藥業(yè)有限公司，湖北京山431800）摘要粘細菌纖維堆囊菌ATCC15384在發(fā)酵培養(yǎng)中使用P450埃博霉素環(huán)氧酶的一種抑制劑，該抑制劑特異性抑制epoK基因產(chǎn)物的生成。重組纖維堆囊菌的epoK基因因隨機誘變而失活，由于埃博霉素聚酮合酶（PKS）基因編碼的改變，生產(chǎn)菌株只產(chǎn)生埃博霉素D和C，而不產(chǎn)生埃博霉素A和B?？焖偕V純化得到埃博霉素D，以其為起始材料采用區(qū)域性-立體選擇性鈀催化大環(huán)內(nèi)酯氮化反應(yīng)半合成埃博霉素D內(nèi)酰胺衍生物。關(guān)鍵詞埃博霉素

2、D內(nèi)酰胺衍生物；埃博霉素D；粘細菌纖維堆囊菌；生物合成；埃博霉素基因簇；聚酮合酶埃博霉素(epothilones）是16元大環(huán)內(nèi)酯化合物。它們首先被G..Hofle及其同事從粘細菌纖維堆囊菌（Sorangiumcellulosum,Myxococcales)中分離提取出來[1]，主要成分為埃博霉素A和B，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。它們在該菌中以2:1的比例產(chǎn)生，被認為是一類新型天然存在的微管解聚抑制劑。盡管在結(jié)構(gòu)上和紫杉醇并不相同，但它們在作為微管聚合和微管穩(wěn)定劑方面有相似的作用機理。與紫杉醇相比，埃博霉素不但具有水

3、溶性好，注射、口服均可的特點，而且在P-糖蛋白表達型的多藥耐藥性（MDR）細胞中也維持很大的細胞毒性，埃博霉素被公認為本世紀(jì)將取代紫杉醇的最有效的抗癌藥物。Fig1StructuresofepothilonesA,BandTaxol作者簡介：閻家麒，1939年生，男，遼寧營口市人，教授，中國藥學(xué)會高級會員，主要研究領(lǐng)域：生物制藥和復(fù)雜結(jié)構(gòu)天然藥物有機合成。聯(lián)系電話：13469789911，E-mail:yanjiq99@126.com9由于埃博霉素全合成步驟繁瑣且產(chǎn)率甚低，凸顯生物合成的可實施性。埃博霉素的生

4、物合成屢見報道[2-5]，但產(chǎn)率低微尚無工業(yè)化應(yīng)用價值。目前，已有5種埃博霉素類似物進入II和III期臨床試驗，它們是埃博霉素B、埃博霉素D、Ixempa（ixabelilone）、ZK-EPO和BMS-310706。埃博霉素D內(nèi)酰胺衍生物(Aza-epothiloneD)是一種埃博霉素重要的衍生物，實驗證明它具有較強的抑制微管解聚功能[6],是一種候選抗癌藥物。埃博霉素D內(nèi)酰胺衍生物結(jié)構(gòu)式如圖2：Fig2StructureofAza-epothiloneD作者以粘細菌纖維堆囊菌（Sorangiumcellu

5、losum）ATCC15384為出發(fā)菌株，使用一種化學(xué)合成的抑制劑，使得epoK基因（P450環(huán)氧酶）發(fā)生突變，得到一個含有失活epoK基因的纖維堆囊菌突變菌株,在埃博霉素生物合成的后修飾過程中，抑制C12-C13環(huán)氧化反應(yīng)，使得埃博霉素C和D向埃博霉素A和B的轉(zhuǎn)化受到遏制，因而只產(chǎn)生埃博霉素C和D而不產(chǎn)生埃博霉素A和B。然后，以色譜純化后的埃博霉素D作為起始原料，經(jīng)區(qū)域性-立體選擇性三苯基膦鈀催化大環(huán)內(nèi)酯氮化反應(yīng)，促使埃博霉素D開環(huán)，得到一種氮酸，再經(jīng)三甲基膦處理，生成亞氨基正膦，經(jīng)水解成為氨基酸。最后用H

6、OBt-EDCl促進氨基酸環(huán)化反應(yīng)，得到標(biāo)的的埃博霉素D內(nèi)酰胺衍生物。1材料與方法1.1菌種和EpoK抑制劑出發(fā)菌株為粘細菌菌株中的纖維堆囊菌（Sorangiumcellulosum）ATCC15384,從美國菌種保藏中心得到。epoK抑制劑為1-(2-甲基-4-噻唑基)-2-甲基己基-1-烯-5-炔-3-乙酸酯，依據(jù)文獻[8]方法合成。91.2培養(yǎng)基與菌株突變出發(fā)菌株接種在固體培養(yǎng)基上，固體培養(yǎng)基成分為：大豆蛋白胨8g/L，馬鈴薯淀粉20g/L，酵母提取物10g/L,無水葡萄糖5g/L，CaCl2·H2O1

7、g/L,MgSO4·7H2O1g/L,Fe-EDTA8mg/L,瓊脂粉15g/L。30℃培養(yǎng)5d后，接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基。液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：大豆蛋白胨10g/L，馬鈴薯淀粉20g/L，酵母提取物4g/L,無水葡萄糖15g/L，CaCl2·H2O1g/L,MgSO4·7H2O1g/L,Fe-EDTA8mg/L，樹脂XAD-1620ml/L。30℃，120r/min，搖床培養(yǎng)4d。加入epoK抑制劑，使終濃度為5.0mmol/L至10.0mmol/L,在30℃下，120r/min，搖床繼續(xù)培養(yǎng)7d。1.2.1

8、檢測培養(yǎng)物中產(chǎn)生的埃博霉素D和埃博霉素C取培養(yǎng)物50ml，用尼龍篩（孔隙150μm）過濾，用少量水沖洗保留在尼龍篩上的樹脂，然后與濾膜一起置于50ml離心管中，加入異丙醇10ml，密封。以180r/min搖動1h，將埃博霉素洗滌下來，然后離心分離1.5ml溶液，將約0.8ml上清液用移液管轉(zhuǎn)移到HPLC試管中。依據(jù)樣品的HPLC分析結(jié)果確定埃博霉素C和D。在上述相應(yīng)菌落的部分平皿上用塑料杯將1cm2