方法簡介ppt課件

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1、PCR方法簡介王媛媛PCR概念PCR即聚合酶鏈式反應（Polymerasechainreaction），是利用單鏈寡核苷酸引物對特定DNA片段進行體外快速擴增的一種方法。PCR原理PCR反應類似于DNA的天然復制過程，由三個循環(huán)的步驟構(gòu)成：模板DNA的變性模板DNA與引物的退火(復性)引物的延伸PCR原理圖解1stcycle2ndcycle3rdcycle過程變性引物退火DNA延伸PCR反應體系DNA模板Primer1Primer2DNA聚合酶dNTPsPCRbufferddH2OPCR體系對反應物的要求引物引物設(shè)計的一般原則長度：一般20—30nt

2、，應大于16nt。堿基分布：隨機或均勻分布，避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列。堿基組成：GC含量在45%—55%之間。二級結(jié)構(gòu)：應避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。堿基配對：引物與模配對，3′端完全配對，5′端可不配對，故可設(shè)計酶切位點或其他需引進的序列。3′端堿基：最好不用A。PCR體系對反應物的要求引物濃度引物濃度引物濃度過高會增加擴增結(jié)果的非特異性，并且會形成二聚體上下游引物的終濃度應該一致PCR體系對反應物的要求DNA聚合酶常用的為從嗜熱水生菌（ThermasaquaticusL.）中提取的DNA聚合酶，稱TaqDNA聚合酶95℃可保持活性70—75℃條件下

3、可表現(xiàn)出最佳的生物活性，延伸速率在70℃時，60—70nt/秒，每分鐘大于3.5kb具體使用時，作為一個普遍規(guī)律，每擴增1kb，可用1分鐘延伸時間堿基錯配率達2×10-4—7.2×10-5酶濃度范圍一般為1～4U/100μl酶量過多會導致非特異產(chǎn)物的增加PCR體系對反應物的要求PCR反應的緩沖液Taq酶標準緩沖液：10mmol/LTris-HCl(pH8.3)50mmol/LKCl1.5mmol/LMgCl2PCR體系對反應物的要求PCR反應的緩沖液Mg2+濃度影響反應特異性和PCR產(chǎn)率。Mg2+最佳反應濃度相當?shù)停?.5mmol/L），濃度變化范圍

4、為1～10mM模板制備過程中帶來的螯合劑（如EDTA）和負電荷離子基團（如磷酸根（dNTP）會影響Mg2+的有效濃度。必要時，對Mg2+濃度進行優(yōu)化。PCR體系對反應物的要求dNTPs高濃度的dNTP會抑制聚合酶活性，而且會增加錯誤dNTP的摻入幾率；濃度過低則會影響產(chǎn)物產(chǎn)量四種dNTP的濃度應該一致PCR反應條件的選擇94℃4min94℃30sTm-5℃30s72℃1min/1kb72℃10minTm=4(G+C)+2(A+T)30cyclesRT-PCR原理ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction:

5、RT-PCR提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因RT-PCR原理圖解RT-PCR反轉(zhuǎn)錄酶的選擇Moloney鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶，有強的聚合酶活性，最適作用溫度為37℃禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性，最適作用溫度為42℃RT-PCR合成cDNA引物的選擇Oligo(dT)與mRNA分子3′端的poly(A)互補特異性強,僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%,此種引物

6、合成的cDNA在數(shù)量和復雜性方面要小難以得到﹥3kbcDNA,對某些RNA二級結(jié)構(gòu)難以克服。RT-PCR合成cDNA引物的選擇隨機六聚體的核苷酸特異性差克服反轉(zhuǎn)錄酶終止反應的序列。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNART-PCR合成cDNA引物的選擇特異性寡核苷酸引物特異性強RACEcDNA末端快速擴增技術(shù)(rapidamplificationofcDNAends)3′RACE原理反轉(zhuǎn)錄：利用mRNA的3′末端天然的poly(A)尾巴作為引物結(jié)合位點，以O(shè)ligo(dT)和一個接頭組成的接頭引物(adaptorprimer,AP)來反轉(zhuǎn)錄

7、總RNA得到加接頭的cDNA第一鏈。第一PCR：然后用一個基因特異引物GSP1(genespecificprimer，GSP)和接頭引物AP進行PCR反應。從而擴增位于已知序列區(qū)和poly(A)尾之間的未知的3′端mRNA序列。第二次PCR：防止非特異帶的產(chǎn)生,可以用GSP2和AP為引物進行第二輪擴增(巢式PCR)5′RACE原理反轉(zhuǎn)錄：與3`RACE原理類似，用一個反向的基因特異引物（GSP-RT)在反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase,RT)作用下反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈加尾：再用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)給cDNA的3′末

8、端進行同聚物加尾反應,從而在未知的cDNA的5′端加上一個poly(A)接頭PCR引物：然后再用基因特異引物