基因的染色體定位

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1、基因的染色體定位關(guān)鍵詞：基因定位熒光原位雜交放射雜交體　　在人類基因組計(jì)劃（HGP）中有二大部分內(nèi)容，一是在2005年之前完成對人類基因組DNA約3×109個核苷酸序列的測定，同時完成對基因的染色體定位工作；二是開展基因功能的研究。基因定位與基因序列兩者相輔相成，基因染色體的定位既有助于基因序列的測定，又有利于對基因結(jié)構(gòu)和功能的研究，有利于進(jìn)一步提示生物的遺傳信息。基因測序技術(shù)，尤其是大規(guī)模測序技術(shù)的建立，極大地提高了基因測序的速度。到1999年1月25日為止，全世界已測出全部人類基因序列的7.3%，而部分生物，如酵母、大腸桿菌等的序列已全部測定完畢，這樣cDNA的染色體定位工作就顯得尤

2、為迫切。然而由于目前的基因大規(guī)模測序是建立在基因定位的基礎(chǔ)之上，而基因組的染色體定位（基因作圖）工作跟不上基因測序技術(shù)的發(fā)展，因而成了限制基因序列測定的主要因素?；虻娜旧w定位方法多種多樣，它可分為基因的遺傳作圖和物理作圖，而物理作圖中最主要是熒光原位雜交（FISH）和放射雜交體（RH）二種。本文就目前主要的幾種基因作圖方法作一介紹?！　?熒光原位雜交（FISH）　　原位雜交（ISH）原早被用于染色體組型和核酸分布的分析，后來，隨著技術(shù)的發(fā)展，它被用于基因染色體定位的研究，特別是非同位素標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，使得ISH的應(yīng)用日前廣泛。目前它已被用于腫瘤的細(xì)胞遺傳改變、人類的早期發(fā)育、核與基因

3、組的分子結(jié)構(gòu)、不同種屬間的基因圖譜比較、動物的細(xì)胞發(fā)生和無數(shù)的基因定位研究。用于基因染色體定位的FISH已被稱為CO-FISH或COD-FISH（chromosomeorientationanddirectionFISH）[1]?！　O-FISH技術(shù)是以生物素或地高辛等半抗原為標(biāo)記物，采用隨機(jī)引物法或缺口平移法標(biāo)記DNA探針，將探針變性后即可用于細(xì)胞分裂中期或間期細(xì)胞核染色體的原位雜交并產(chǎn)生DNA-DNA雜交體，這種雜交體可以被與半抗原有高度親和力的熒光標(biāo)記分子所檢測到，而這種雜交信號又可以被與熒光分子偶聯(lián)的單抗所放大。此外，DNA探針也可以直接標(biāo)以熒光分子，這些熒光分子有：FITC、

4、德克薩斯紅（texasred）及最近開發(fā)的花青染料（cyaninedyes）等，如果這樣，就不需要進(jìn)行信號檢測和放大就可以直接觀察DNA-DNA雜交體[2]。用于FISH的DNA底物已經(jīng)由原先固定的染色體和間期細(xì)胞核發(fā)展到伸展的單鏈DNA分子、細(xì)胞核及染色體的自然形態(tài)等[3]。由于FISH技術(shù)已經(jīng)可以在伸展的DNA分子上進(jìn)行，這樣它的分辨率就達(dá)到1～2kb，并能在此區(qū)域內(nèi)作圖。而傳統(tǒng)的在細(xì)胞中期和間期進(jìn)行的FISH只能分別分辨1～5Mb和50kb左右的區(qū)域，分辨率的提高使得更詳細(xì)的基因結(jié)構(gòu)和基因內(nèi)重排研究成為可能；FISH對自然狀態(tài)下細(xì)胞和染色體的研究可以闡明核成分的分布并且不會出現(xiàn)象計(jì)

5、算機(jī)三維重建分析時的干擾現(xiàn)象；同時，還能對二條同源染色體轉(zhuǎn)錄活性的核功能進(jìn)行研究，并可直接觀察基因表達(dá)過程中核成分的位置。FISH不僅能對固定的標(biāo)本進(jìn)行研究，還能對新鮮的標(biāo)本進(jìn)行研究，更有報道認(rèn)為它能分辨單一堿基的替換[4]?！　∮糜诨蚨ㄎ坏腇ISH技術(shù)經(jīng)歷了從用洗滌劑或堿裂解液處理細(xì)胞核產(chǎn)生伸展?fàn)钊旧|(zhì)，從機(jī)械拉展染色質(zhì)到分子梳，再到最近的動態(tài)分子梳技術(shù)(dynamicmoleularbingDMC)[5]。DMC技術(shù)是分子梳技術(shù)和熒光雜交技術(shù)的結(jié)合，它分為四個步驟：①制備三氯硅烷包被的玻片；②從低熔點(diǎn)瓊脂糖膠中制備DNA溶液；③將玻片浸于溶液里5分鐘，使DNA結(jié)合到玻片上；④用30

6、0μm/s的速度將玻片從溶液中抽出。由于在玻片-溶液界面處，浸在溶液中的部分對已抽出部分有一種持續(xù)的回復(fù)力，加上它們的疏水性，硅烷的表面很快就干燥，使得被拉長的DNA纖維不可逆地被固定于玻片表面，這種DNA纖維呈平等狀、單方向分布，似梳子狀。整個表面的伸展是均一的（2kb/μm），它不受DNA片段大小的影響。與其它方法相比，DMC技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：①在整個平面的伸展可使雜交信號為單一信號，無需標(biāo)化。②不同的表面和不同的溶液中DNA的伸展無變化。③高密度的基因組DNA和雜交信號可使統(tǒng)計(jì)分析在一張22×22mm的載玻片上即可進(jìn)行。④一定的DNA斷裂可產(chǎn)生持續(xù)的可分析數(shù)百kb的DNA片段。⑤可從

7、同一種DNA溶液中制備出許多伸展平面?！　?放射雜交體法（RH）　　盡管FISH技術(shù)可以對基因進(jìn)行染色定位，但是從分子角度來看，它的定位工作仍顯得較粗糙，它只能將基因定位于百萬個堿基的范圍（2%的染色體長度）。因此發(fā)展一種較敏感的技術(shù)勢在必行。RH就是在這樣的情況下產(chǎn)生的，它的基礎(chǔ)是Goss和Harris早期的工作，他們用大劑量的X射線照射細(xì)胞，使染色體斷裂；但是通過細(xì)胞融合嚙齒動物細(xì)胞DNA中并被其修復(fù)。在染色體上間隔越遠(yuǎn)的兩個標(biāo)