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《內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶 0引言 內(nèi)質(zhì)X應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress,ERS)是指在多種生理或病理條件下細(xì)胞內(nèi)質(zhì)X鈣穩(wěn)態(tài)失衡或蛋白質(zhì)加工運輸障礙、生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細(xì)胞器的病理過程[1-3],涉及內(nèi)質(zhì)X類似激酶(proteinkinaseRNA-likeendoplas-micreticulumkinase,PERK)/真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(eukaryoticinitiationfactor2α,eIF2α)、激活轉(zhuǎn)錄因子6(activatingtranscriptionfactor6,
2、ATF6)和需肌醇酶-1(inositol-requiringkinase1,IRE-1α)/X盒結(jié)合蛋白-1(X-boxbindingpro-tein-1,XBP-1)等信號通路[4-6],而葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulatedprotein78,GRP78)是細(xì)胞ERS狀態(tài)的標(biāo)志物[7,8].內(nèi)質(zhì)X氧化還原酶-1α(endoplasmicreticulumoxidoreductin1α,ERO1α)是調(diào)控內(nèi)質(zhì)X腔中蛋白合成、折疊的關(guān)鍵基因[9,10].同型半胱氨酸(homocyste-ine
3、,Hcy)是多種疾病的危險因子,可引起肝臟ERS[11,12].本研究主要探討Hcy誘導(dǎo)肝細(xì)胞ERS過程中ERO1α的調(diào)控作用及可能機(jī)制,為進(jìn)一步尋找Hcy致肝臟ERS中的作用靶點提供實驗依據(jù). 1材料和方法 1.1材料HL7220肝細(xì)胞株(四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心,中國);超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,中國);CO2培養(yǎng)箱(Heraeus,德國);5415D型微量臺式離心機(jī)(Eppendorf,德國);BS110S型精密天平(Sartorius,德國);熒光顯微鏡(奧林巴斯公司,日本);熒光定量PCR儀(上海楓嶺生物技術(shù)有限公司,中國);
4、垂直電泳儀和Model680全自動酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司,美國);HyCloneRPMI1640培養(yǎng)基(Thermo);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);Hcy(Sigma);RNA提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司,中國);逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒(美國Invitrogen公司);蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,中國);ERO1α兔抗人一抗(Abcam公司),辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,中國);GRP78、PERK、ATF6、XBP-1ELISA試劑盒(北京
5、雅安達(dá)公司,中國);引物由上海生工生物工程有限公司合成. 1.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):將人肝細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng).細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時,用終濃度為0、50、100、200、500μmol/LHcy和100μmol/LHcy+葉酸+VB12干預(yù),其中0μmol/LHcy為對照組,48h后收集細(xì)胞,用于后續(xù)試驗. 1.2.2ELISA檢測ERS相關(guān)蛋白GRP78、PERK、ATF6、XBP-1的水平:ELISA試劑盒室溫平衡15min,分別設(shè)空白孔、待測樣品孔.
6、空白孔加樣品稀釋液100μL,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μL(待測樣品蛋白上樣濃度統(tǒng)一為21g/L),37℃反應(yīng)30min.洗板5次,各1min,拍干.每孔加酶標(biāo)液100μL,37℃反應(yīng)30min,洗板5次,各1min,拍干.加顯色試劑A液和B液,37℃顯色15min.加終止液,15min內(nèi),酶標(biāo)儀上讀取各孔A450值. 1.2.3實時定量PCR檢測ERO1αmRNA水平:按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性.按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;采用Primer5.0軟件設(shè)計引物,
7、ERO1α:5'-ATCCTTTG-GCTTCTGGTCAAG-3'(上游)和5'-GTTGT-GTCCCCATTTCTTTTCT-3'(下游);β-actin:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'(上游)和5'-CTGGAAGGTGGACAGCGACG-3'(下游). PCR條件:94℃預(yù)變性10min,94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延長30s,擴(kuò)增40個循環(huán).待反應(yīng)結(jié)束后,結(jié)合擴(kuò)增曲線及溶解曲線,選擇符合要求的qRT-PCR原始數(shù)據(jù),結(jié)果用2
8、-△△CT法分析. 1.2.4200
