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《血清球蛋白的分離純化（純化部分）課件》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、生化教研室血清γ-球蛋白的分離純化——鹽析、層析技術(shù)1.掌握分離純化蛋白質(zhì)的基本原理和基本過(guò)程2.熟悉鹽析、離心、層析等生化基本技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化中的綜合應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧蛩徜@鹽析初步分離γ-球蛋白鹽析原理中性鹽能破壞蛋白質(zhì)溶液的水化膜,中和蛋白質(zhì)的表面電荷,從而使蛋白質(zhì)聚集沉淀分段鹽析由于不同蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度、所帶電荷的不同，鹽析所需的鹽濃度也是不同的。當(dāng)調(diào)節(jié)不同的鹽濃度，不同蛋白質(zhì)將會(huì)分段沉淀，即分段鹽析。50％飽和的硫酸銨能使血清中的球蛋白沉淀，而33％飽和的硫酸銨則使γ-球蛋白沉淀。分離
2、γ-球蛋白理論依據(jù)實(shí)驗(yàn)試劑及器材離心管、離心機(jī)，滴管等血清，飽和硫酸銨溶液，PBS溶液等血清1ml(20d)飽和硫酸銨0.5ml(10d)G充分混勻離心5min4000rpmγ-G1.33%硫酸銨鹽析分離γ-球蛋白2.γ-球蛋白溶液的制備PBS0.5ml(10d)（1）離心管要平衡對(duì)稱；（2）離心機(jī)的啟動(dòng)、停止都要慢；（3）開始前，蓋子蓋緊；結(jié)束后，減速、關(guān)電源、自然停止。（4）過(guò)程中，若有異響，立即停止，檢查離心管。離心機(jī)的使用方法及注意事項(xiàng)：二.凝膠層析純化γ-球蛋白凝膠層析的定義又稱凝膠過(guò)濾、分子篩
3、層析、排阻層析、凝膠滲透層析等凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對(duì)大小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離，稱凝膠層析。葡聚糖凝膠顆粒凝膠層析的原理物質(zhì)進(jìn)入凝膠柱之后有兩種運(yùn)動(dòng)方式：垂直向下移動(dòng)和無(wú)定向的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。被分離物質(zhì)因分子大小不同，在凝膠中向下移動(dòng)的速度不同。實(shí)驗(yàn)器材及試劑器材層析柱，白瓷板，試管，滴管等試劑PBS緩沖液，雙縮脲試劑、Nessler試劑等平衡上樣洗脫清洗收集并檢測(cè)凝膠層析脫鹽凝膠處理裝柱①自然溶漲法將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)
4、的小顆粒傾瀉出去1.凝膠處理②加熱法在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時(shí)即可達(dá)到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒。2.裝柱（1）裝柱前準(zhǔn)備:將層析柱下端的止水螺絲旋緊，往層析柱加入2-3ml洗脫液,以確保凝膠底部沒(méi)有氣泡。（2）裝柱：把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊倒入柱中，同時(shí)開啟止水螺絲，控制一定的流速，使柱中的凝膠一直處在溶液中。最好一次連續(xù)裝完，待凝膠裝至10-15cm即可。注意防止氣泡與分層,可用玻棒攪拌使表面平整。3.平衡通過(guò)2-3倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，并始終保護(hù)凝膠上端
5、有一段液體。將柱中多余的液體從底部流出后關(guān)閉止水螺絲，取前面制備好的γ-球蛋白樣品小心加到凝膠柱上，打開止水螺絲，使樣品溶液流入柱內(nèi)，當(dāng)樣品流至略高于柱床表面時(shí)，關(guān)閉止水螺絲。4.上樣用緩沖液進(jìn)行洗脫，控制緩沖液在約每5秒一滴的流速。5.洗脫收集洗脫液，每管收集12d，共收集12管，同時(shí)對(duì)收集液體進(jìn)行檢測(cè)。6.收集與檢測(cè)蛋白質(zhì)檢測(cè)在各收集管中各取出1滴收集液滴于比色板孔中(按編號(hào)順序)，加入1滴雙縮脲試劑，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。從收集到的試管中取收集液1滴于比色板中，加入奈氏試劑1滴，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。N
6、H4+檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用洗脫液加滿柱子，加快流速，清洗層析柱。清洗完畢后，保持膠面上方有4-5cm高度緩沖液，關(guān)閉止水螺絲。7.清洗
