發(fā)酵條件優(yōu)化實驗

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1、發(fā)酵過程培養(yǎng)基成分配比優(yōu)化綜合實驗一、目的要求掌握發(fā)酵條件優(yōu)化實驗設計方法；掌握高壓滅菌技術；提高實驗動手能力和數(shù)據(jù)分析的能力。二、基本原理發(fā)酵條件中培養(yǎng)基的配置可參照前人的經(jīng)驗配方，再結(jié)合菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶等小發(fā)酵設備對碳、氮、無機因子等單因子逐個試驗，觀察這些因子對菌體生長和產(chǎn)物合成的影響，再綜合考慮各因素的影響。一個培養(yǎng)基設計的過程大約經(jīng)過以下幾個步驟：①根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基成分確定實驗時一些必須考慮的因素，初步確定可能的培養(yǎng)基成分；②通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；③當培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實驗次數(shù)

2、可考慮用“正交試驗設計”等方法確定培養(yǎng)基的組分和濃度。正交試驗法定義：用正交表安排多因素試驗與分析試驗結(jié)果的辦法，簡稱正交試驗。因素：影響試驗指標的條件水平：因素所處的狀態(tài)簡化試驗次數(shù)諸因素中哪些因素對指標的影響較大，哪些因素較小。所考察的因素各取什么水平能使實驗指標較好指標在不同水平時的變化規(guī)律等正交試驗意義正交實驗設計是安排多因子的一種常用方法，通過合理的實驗設計，可用少量的具有代表性的試驗來代替全面試驗，較快地取得實驗結(jié)果。具體可以分為下面四步：①根據(jù)問題的要求和客觀的條件確定因子和水平，列出因子水平表；②根據(jù)因子和水平數(shù)選用合適的正交表，設計正交表頭，并安排實驗；③根據(jù)正交表

3、給出的實驗方案，進行實驗；④對實驗結(jié)果進行分析，選出較優(yōu)的“試驗”條件以及對結(jié)果有顯著影響的因子。常用的正交表例如：L4（23），L16（44），L27（313）正交表格式：Ln（tq）L代表正交表，n代表實驗次數(shù)，t代表因素水平數(shù)，q代表因素數(shù)。常用的正交表可查閱有關統(tǒng)計學書籍直接套用。正交表選擇依據(jù)：在能容納所研究的因素數(shù)和因素水平數(shù)的前提下選用試驗次數(shù)最少的正交表來安排試驗正交表安排試驗注意事項：盡可能使各因素的水平數(shù)相等，試驗的重復次數(shù)相當。例如考察細菌發(fā)酵產(chǎn)酸生產(chǎn)中最大糖酸轉(zhuǎn)化率，探索發(fā)酵最佳工藝，準備對葡萄糖、尿素、玉米漿和KH2PO4濃度進行優(yōu)化。（四因素）正交設計表表

4、頭設計考察指標：糖酸轉(zhuǎn)化率（％）L16(44)正交實驗正交實驗結(jié)果直觀分析實驗結(jié)果分析各因素對產(chǎn)酸影響的大小順序為：葡萄糖>KH2PO4>尿素>玉米漿，各因素的水平為：A2，B3，C2，D3由此最終確立了菌株的優(yōu)化配方：葡萄糖4％；尿素1.5％；玉米漿1％；KH2PO40.5％。直觀分析優(yōu)點：簡便、計算工作量小直觀分析缺點：判斷因素效應的精度不夠，也不能給出誤差的大小。三、實驗路線正交實驗配方設計　　配置液體培養(yǎng)基　　接種　　培養(yǎng)　　離心　取沉淀（胞內(nèi)產(chǎn)物）　細胞破碎　　溶解　　包涵體干擾素重組蛋白檢測四、實驗材料一）菌種：重組大腸桿菌；二）培養(yǎng)基及試劑：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、

5、溶菌酶、裂解緩沖液：50mMTris-HClpH7.5，50mMNaCl、2M尿素；三）其它材料：試管、接種環(huán)、高壓蒸汽滅菌鍋、光學顯微鏡、酒精燈、水浴搖床、離心機、冰箱等。五、實驗步驟１、將重組大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，做為液體種子備用；（老師已準備好）２、根據(jù)文獻和初步研究結(jié)果，確定基礎培養(yǎng)基成分：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉，其基礎濃度為１%、0.5%、1%；３、采用三因素、三水平正交實驗設計，配制9組不同培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，每組3個重復；（5ml/支）4、配PBS、裂解液、2M尿素5、培養(yǎng)基、PBS121℃、20min高壓蒸氣滅菌，待冷卻后，按5%接種

6、量接種，放入37℃液體搖床250rpm，3.5h后加入IPTG誘導后繼續(xù)震蕩培養(yǎng)5h；6、收集每管重組大腸桿菌菌液，3000rpm離心10min,棄上清，留沉淀，－20℃與室溫下反復凍融沉淀3次；7、細菌的裂解：將菌體沉淀混勻在9×體積PBS中，4℃孵育5min。3000rpm離心10min后，稱取菌體的濕重，每克濕重的菌體加入10ml裂解緩沖液，1mg溶菌酶重懸，充分混勻，37℃0.5h。8、洗滌與純化：12000rpm(擬為4000)離心10min,獲取沉淀，用2M尿素洗滌2次(擬刪)，得到包涵體的粗提物；9、稱取包涵體的重量，以此初步判斷每組培養(yǎng)條件下重組大腸桿菌的蛋白表達量；

7、10、采用正交實驗直觀分析法進行實驗結(jié)果分析，確定較優(yōu)的培養(yǎng)基濃度。六、實驗結(jié)果與分析1、討論直觀法正交實驗分析的優(yōu)缺點；2、應用正交實驗直觀法確定重組干擾素產(chǎn)生菌大腸桿菌培養(yǎng)基成分的優(yōu)化配比，作為進一步發(fā)酵罐發(fā)酵依據(jù)。