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《陜西地區(qū)乙型肝炎患者血清中病毒的基因分型》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、陜西地區(qū)乙型肝炎患者血清中病毒的基因分型關(guān)鍵詞:肝炎病毒，乙型;基因型;聚合酶鏈反應(yīng);多態(tài)性，限制性片段長度摘要:目的了解陜西地區(qū)乙肝病毒（HBV）基因分型情況.方法用套式PCR方法從100份HBsAg陽性的乙型肝炎患者血清中擴(kuò)增585bp的S基因，用限制性內(nèi)切酶BsrⅠ，StyⅠ，DpnⅠ和HpaⅡ平行酶切鑒別HBVA～F基因型.結(jié)果所有標(biāo)本用內(nèi)引物P1和P2均擴(kuò)增獲得的585bp的靶基因，繼之用上述限制性內(nèi)切酶消化鑒定，證明100份血清標(biāo)本中的HBV可分為B型36份（36%），C型56份（56%），D型8份（8
2、%）.結(jié)論陜西地區(qū)HBV分型以B，C型為主，D型較少，未發(fā)現(xiàn)A，E，F(xiàn)型.結(jié)果同時(shí)表明PCR-RFLP方法靈敏性高，特異性強(qiáng)，且酶切圖譜簡明單一，易于識(shí)別，適用于HBV基因型的流行病學(xué)調(diào)查和臨床實(shí)驗(yàn)研究. Keyerasechainre-action;polymorphism，restrictionfragmentlength Abstract:AIMToinvestigatethegenotypesofHepatitisBvirus（HBV）inShaanxiprovince.METHODSThe585bpl
3、engthofHBVSgeneplifiedfromthebloodsamplesof100patientserasechain reaction（PCR）.ThePCRproductses，BsrⅠ，StyⅠ，DpnⅠandHpaⅡtodeterminethegenotypingofHBV.RESULTSByPCR-RFLP，HBVfrompatientsainlyconsistsoftypeBandtypeC，andtypeDisrareinthisregion. 0引言 已知乙型肝炎病毒（HBV）可分為A
4、，B，C，D，E，F(xiàn)，G7個(gè)基因型［1-3］，我國主要以B型和C型為主，D型比較少見，少數(shù)民族多以D型為主，還未發(fā)現(xiàn)其他型別［4］.人類感染不同基因型HBV可能與感染途逕、疾病的感染譜及疾病的進(jìn)展有一定的相關(guān)［5］.目前進(jìn)行HBV分型的方法主要有3種:①病毒全基因組或S基因序列測(cè)定和分析［1，2］;②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）［6］;③單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附法［7］.由于病毒基因測(cè)序法技術(shù)較為復(fù)雜，不便于臨床或流行病學(xué)調(diào)查工作中常規(guī)應(yīng)用;單克隆抗體分型法則難以從基因水平上對(duì)HBV進(jìn)
5、行分型，因此我們選用PCR-RFLP進(jìn)行HBV的基因型別鑒定，以了解陜西地區(qū)HBV流行毒株的型別和特點(diǎn). 1對(duì)象和方法 1.1對(duì)象選取本院保存的陜西籍慢性乙型肝炎患者血清標(biāo)本100（男62，女38）份;年齡4～60（平均32.4±4.2）歲.全部標(biāo)本HBsAg陽性，臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)符合第五屆全國傳染病和寄生蟲病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的病毒性肝炎防治方案. 1.2檢測(cè)方法 1.2.1血清HBV-DNA的提取取20μL血清加40μLDNA裂解液，在沸水中煮10min，離心后吸取上清液待檢. 1.2.2套式PCR外引物核苷酸
6、（nt）序列為:S1（nt2820-2837，5’-GGGACACCATATTCTTGG-3’）和S2（nt842-822，5’-TTAGGGTTTAAATGTAT-ACCCA-3’）;內(nèi)引物的nt序列為:P1（nt203-221，5’-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3’）和P2（nt788-768，5’-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3’），所有引物均由天津九鼎鑫公司合成. 1.2.3PCR擴(kuò)增及限制性內(nèi)切酶酶切分析兩輪套式PCR按常規(guī)進(jìn)行.第1輪PCR反應(yīng)系統(tǒng)組成為:待檢上清液4μL，
7、10×PCR緩沖液5μL，dNTP4μL，S1/S2各1.5μL，加無離子水至50μL反應(yīng)體積.擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性300s，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán).第2輪PCR反應(yīng)系統(tǒng)組成為:第1輪反應(yīng)產(chǎn)物4μL，10×PCR緩沖液5μL，dNTP4μL，P1/P2各1.5μL，Taq酶2U，加無離子水至50μL反應(yīng)體積.擴(kuò)增條件和循環(huán)次數(shù)同第1輪PCR［8-10］.擴(kuò)增的靶基因經(jīng)瓊脂糖電泳初步鑒定粗純后分成若干份，選擇限制性內(nèi)切酶StyⅠ，BsrⅠ，HpaⅡ，DpnⅠ分別或組合
8、進(jìn)行酶切［11］，取消化產(chǎn)物8～10μL加入20g・L-1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，根據(jù)不同的電泳圖譜進(jìn)行RFLP分析以確定HBV基因型. 2結(jié)果 2.1基因型與S基因限制性片段長度多態(tài)性的關(guān)系經(jīng)用內(nèi)引物P1和P2擴(kuò)增獲得的的靶基因片段長度為585bp（Fig1），其中HBVC基因型在此片段中的第301位有限制性內(nèi)切酶StyⅠ的酶切位點(diǎn)，識(shí)別序
