葉綠素含量測(cè)定

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1、葉綠素含量的測(cè)定一.實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即A＝αCL.式中：α比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，α為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和。就是吸光度的

2、加和性。如欲測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三特定波長(zhǎng)下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。植物葉綠素含量測(cè)定----丙酮提取法高等植物光合作用過(guò)程中利用的光能是通過(guò)葉綠體色素(光合色素)吸收的。葉綠體色素由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。葉綠體色素的提取、分離和測(cè)定是研究它們的特性以及在光合中作用的第一步。葉片葉綠素含量與光合作

3、用密切相關(guān)，是反眏葉片生理狀態(tài)的重要指標(biāo)。在植物光合生理、發(fā)育生理和抗性生理研究中經(jīng)常需要測(cè)定葉綠素含量。葉綠素含量也是指導(dǎo)作物栽培生產(chǎn)和選育作物品種的重要指標(biāo)。l葉綠素不溶于水，溶于有機(jī)溶劑，可用多種有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇或二甲基亞砜等研磨提取或浸泡提取。葉綠色素在特定提取溶液中對(duì)特定波長(zhǎng)的光有最大吸收，用分光光度計(jì)測(cè)定在該波長(zhǎng)下葉綠素溶液的吸光度(也稱為光密度)，再根據(jù)葉綠素在該波長(zhǎng)下的吸收系數(shù)即可計(jì)算葉綠素含量。l利用分光光計(jì)測(cè)定葉綠素含量的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液時(shí)，溶液的吸

4、光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：lA=Kbc式中：A為吸光度；K為吸光系數(shù)；b為溶液的厚度；c為溶液濃度。l葉綠素a、b的丙酮溶液在可見(jiàn)光范圍內(nèi)的最大吸收峰分別位于663、645nm處。葉綠素a和b在663nm處的吸光系數(shù)（當(dāng)溶液厚度為1cm，葉綠素濃度為g·L-1時(shí)的吸光度）分別為82.04和9.27；在645nm處的吸光系數(shù)分別為16.75和45.60。根據(jù)Lambert-Beer定律,葉綠素溶液在663nm和645nm處的吸光度（A663和A645）與溶液中葉綠素a、b和總濃度（a+b）

5、（Ca、Cb、Ca十b，單位為g·L-1），的關(guān)系可分別用下列方程式表示：lA663=82.04Ca+9.27Cb（1）lA645=16.76Ca+45.60Cb（2）lCa=12.7A663—2.59A645(3)lCb=22.9A645—4.67A663(4)lCa十b＝20.3A645—8.04A663(5)ll從公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要測(cè)得葉綠素溶液在663nm和645nm處的吸光度，就可計(jì)算出提取液中的葉綠素a、b濃度和葉綠素總濃度（a+b）。ll所測(cè)定材料的單位面積或單位重量的葉綠素含量可

6、按下式進(jìn)行計(jì)算：l葉綠素含量（mg·g-1或mg·dm-2）=C×VlA×1000l式中：C為葉綠素濃度（mg·L-1）或mg·dm-2）；V為提取液總體積（ml）；A為取樣鮮重（g）或取樣面積（dm-2）。80%丙酮提取液中色素濃度計(jì)算公式:(濃度單位：mg/L）Ca=12.21A663–2.81A646Cb=20.13A646–5.03A663CT=Ca+Cb=17.32A646–7.18A663Cx.c=(1000A470–3.27Ca–104Cb)/229l植物組織中單位鮮重各色素的含量(mg.g/L)l葉綠

7、體色素的含量=l色素的濃度(mg.L-1)×提取液體積(L)×稀釋倍數(shù)l樣品鮮重(或干重,面積,g或m2)二.試劑與材料2.1試劑：丙酮、石英砂、碳酸鈣2.2材料：菠菜的新鮮葉片。2.3儀器與器皿：分光光度計(jì)、臺(tái)秤、剪刀、研缽、移液管、漏斗、大試管三.實(shí)驗(yàn)步驟葉片洗凈、吸干、去大葉脈↓稱0.5g葉用丙酮研磨↓勻漿過(guò)濾（用80%丙酮洗研缽及殘?jiān)?，合并濾液）↓濾液用80%丙酮定容至10mL↓適當(dāng)稀釋后測(cè)A645、A663四.結(jié)果計(jì)算4.1結(jié)果計(jì)算C(mg/L)×提取液總量（L）×稀釋倍數(shù)Chl=(mg/g葉)材料鮮重（g

8、）4.2比較分析不同植物的葉綠素含量差異及同種植物在不同生長(zhǎng)環(huán)境下Chla/Chlb差異。五.注意事項(xiàng)l注意葉綠素一定要提干凈，避免造成測(cè)定誤差l葉綠素初提液體積不要太多，以免浪費(fèi)試劑，如果濃度太高可進(jìn)行適當(dāng)稀釋l注意分光光度計(jì)的規(guī)范使用六.思考題l為什么植物在不同生長(zhǎng)環(huán)境下其Chl含量有差異？Chla/Chlb有何適應(yīng)意義？