高效液相出現(xiàn)雙峰原因

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1、HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下（不包括梯度），峰型應(yīng)對稱而尖銳。但是，在對樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進樣方式不合理下，會出現(xiàn)各種意想不到的問題，而對色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對于新手更是如此。下面根據(jù)本人幾年工作的體會，提出一些看法，向同仁指教。色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。我將這種情況分為四種原因。1色譜柱如果你分析樣品時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質(zhì)時，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進樣量少，原來

2、色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應(yīng)柱效很低而報廢。2溶劑極性及進樣量許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻都不會提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個很重要的原因。目前HPLC分

3、析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。當用溶劑極性強度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰?。看味疾惶粯樱?，且拖尾，保留時間會提前(相對進樣量少而言)，將進樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎！＿@是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的。上面提到進樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊

4、靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由于進樣量過大，色譜柱過載造成的。3樣品的特性有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個動態(tài)平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質(zhì)譜檢測器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇（吡蟲清）。4參數(shù)記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如C－

5、R3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2ms，HPLC為5ms，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變?yōu)槎€峰或更多。高效液相反相梯度色譜中出現(xiàn)鬼峰的原因???鬼峰產(chǎn)生的原因是多種多樣的，現(xiàn)將原因歸納為以下幾個方面：???1、流動相、樣品稀釋液、儀器或是容器中存在雜質(zhì)，當梯度開始時由于有機相比例不高，洗脫能力不強，雜質(zhì)在色譜柱柱頭富集，隨著流動相比例變化，洗脫能力增強，富集的雜質(zhì)被洗脫，從而形成鬼峰。2、流動相脫氣不完全?？諝庠谟袡C相和水中的溶解度不同，當水和有機相混合時，氣泡就產(chǎn)生了。3、操作問題原因1主要有以下幾種情況1、試劑問題a)有機溶劑甲醇制備工藝相對乙腈來說較為簡單，雜質(zhì)含量也

6、較少。但是由于甲醇紫外吸收范圍比乙腈廣，所以當使用紫外檢測器時，尤其是波長較低時，盡量使用乙腈作為有機相，用甲醇的話漂移太大。而用作梯度色譜的乙腈質(zhì)量要求較高，一般用進口梯度色譜專用乙腈能夠很好的減少鬼峰的出現(xiàn)。b)水很多單位用自制蒸餾水作為水相，但是結(jié)果并不是很好。原因就是一些低沸點的有機雜質(zhì)并不能夠通過蒸餾除掉。有條件的盡量用HPLC級的純水，沒有條件的也可用娃哈哈或是屈臣氏等水代替，但是如果色譜條件比較嚴格也是有可能出問題的。c)其它試劑緩沖鹽、TFA、EDTA等試劑也會對流動相造成很大的影響，盡量用純度高的試劑配制流動相。2、儀器問題a)液相的流動相管路被污染。長時間的使用含水量

7、較高的流動相（尤其是加入緩沖鹽的），細菌就容易在管路中滋生，細菌的代謝產(chǎn)物或是細胞碎片能造成鬼峰。b)輸送泵故障，造成系統(tǒng)壓力不穩(wěn)，從而產(chǎn)生鬼峰。c)單向閥堵塞，造成系統(tǒng)壓力不穩(wěn)，從而產(chǎn)生鬼峰。早期島津的液相單向閥貌似不能用純乙腈作為流動相，現(xiàn)在應(yīng)該已經(jīng)得到改進。原因2主要有以下幾種情況1、在線脫氣機脫氣不完全。2、兩種流動相的有機相比例相差太大。例如A為100%^水，B為100%^乙腈。在梯度條件允許的情況下盡量減少兩中流動相之間