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1、金屬銅離子與蛋白質(zhì)內(nèi)容：研究的目的及意義銅與血清白蛋白銅與血紅蛋白銅蛋白和銅酶研究目的及意義在真核生物體內(nèi)，銅元素參與體內(nèi)的許多生化反應(yīng)，如作為電子傳遞鏈中的供體或受體；參與細(xì)胞內(nèi)的呼吸；維持鐵的代謝平衡；用于色素、神經(jīng)遞質(zhì)的合成；作為氧化還原酶參與體內(nèi)的抗氧化過程。但體內(nèi)銅離子濃度過高時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性，改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)；與某些氨基酸殘基的側(cè)鏈發(fā)生非特異反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊；與其它物質(zhì)競爭酶的活性中心，干擾酶的正常功能；產(chǎn)生活性氧損害機(jī)體的DNA、蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)。所以，研究銅離子與生物分子的作用有重要意義。銅與血清白蛋白血清白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì),它可以與許多內(nèi)
2、源性或外源性化合物結(jié)合,在生命體內(nèi)起著重要的儲(chǔ)存和輸運(yùn)作用。血清白蛋白是由肝臟合成的一種簡單蛋白質(zhì)，僅由氨基酸組成，沒有修飾基團(tuán)和其他附屬物。常以BSA(bovineserumalbumin,牛血清白蛋白)和HSA(humanserumalbumin,人血清白蛋白)為研究對(duì)象。人血清白蛋白主要應(yīng)用于臨床、新陳代謝和遺傳方面的研究，而牛血清白蛋白常常作為蛋白模型進(jìn)行體外研究，如用于細(xì)胞培養(yǎng)，抗體載體等。BSA分子由583個(gè)氨基酸殘基組成。而HSA比BSA多2個(gè)氨基酸，即585個(gè)氨基酸殘基組成。兩者的差異在于BSA缺失HSA氨基酸序列116位和585位的殘基。熒光光譜法由于血清白蛋白
3、含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基,從而能發(fā)出熒光。在這些基團(tuán)中Trp起主要作用,Tyr次之,Phe很弱可忽略，所以，一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸的貢獻(xiàn)。當(dāng)金屬離子與血清白蛋白結(jié)合后,可引起蛋白質(zhì)或少數(shù)金屬離子(稀土離子)熒光的改變,由此可進(jìn)行定性、定量研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。常用熒光猝滅法測定金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合數(shù)和結(jié)合常數(shù),用共振能量轉(zhuǎn)移法測定金屬離子與蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基之間的距離。熒光淬滅可以分為靜態(tài)淬滅和動(dòng)態(tài)淬滅。能降低熒光體發(fā)光強(qiáng)度的分子稱為猝滅劑?；鶓B(tài)熒光分子與猝滅劑之間通過弱的結(jié)合生成復(fù)合物,且該復(fù)合物使熒光完全猝滅的現(xiàn)象稱為靜態(tài)猝滅。而激發(fā)態(tài)熒光分子與猝滅
4、劑碰撞使其熒光猝滅則稱為動(dòng)態(tài)猝滅。圖:Cu2+對(duì)BSA溶液熒光發(fā)射光譜的影響研究發(fā)現(xiàn)Cu2+能夠明顯猝滅BSA自身的特征熒光光譜,并且這種猝滅作用隨著Cu2+的濃度的增大而增強(qiáng)。由于BSA自身的特征熒光主要是其色氨酸殘基(Trp)產(chǎn)生的,表明隨著Cu2+濃度的增加,BSA的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化,使Trp暴露出來,造成BSA的熒光猝滅,猝滅機(jī)理主要為靜態(tài)猝滅。N-端三肽鏈(HSA為Asp1-Ala2-His3,BSA為Asp1-Thr2-His3)公認(rèn)是Cu2+(Ⅱ)的強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)。通常金屬離子與Asp1的α-NH:和His3的咪唑基N及2個(gè)去質(zhì)子肽氮(加上軸向的Asp1的羧基)配
5、位,形成平面四邊形(四方錐)構(gòu)型。N-端三肽鏈能夠結(jié)合金屬離子的原因應(yīng)該是在于His咪唑基N的配位能力,還有三肽鏈的靈活易變,可以折疊圍繞金屬離子形成所需的特定空間構(gòu)型。銅離子與血紅蛋白1.血紅蛋白簡介血紅蛋白（Hemoglobin,簡稱Hb）在體內(nèi)擔(dān)任的功能是輸送氧氣，它能把從肺攜帶的氧經(jīng)由動(dòng)脈血運(yùn)送給組織，又能攜帶組織代謝所產(chǎn)生的二氧化碳經(jīng)靜脈血送到肺再排出體外。血紅蛋白化學(xué)式為C3032H4816O812N780S8Fe4其分子量約為64500，是含有4個(gè)肽鏈的四聚體。它是由四個(gè)亞基構(gòu)成，分別為兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基，血紅蛋白的每個(gè)亞基由一條肽鏈和一個(gè)血紅素分子構(gòu)成。肽鏈在
6、生理?xiàng)l件下會(huì)盤繞折疊成球形，把血紅素分子抱在里面，這條肽鏈盤繞成的球形結(jié)構(gòu)又被稱為珠蛋白。血紅素分子是一個(gè)具有卟啉結(jié)構(gòu)的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四個(gè)吡咯環(huán)上的氮原子與一個(gè)亞鐵離子配位結(jié)合，珠蛋白肽鏈中第8位上一個(gè)組氨酸殘基中的氮原子從卟啉分子平面的上方與亞鐵離子配位結(jié)合。血紅素與血紅蛋白結(jié)構(gòu)當(dāng)血紅蛋白不與氧結(jié)合的時(shí)候，有一個(gè)水分子從卟啉環(huán)下方與亞鐵離子配位結(jié)合，而當(dāng)血紅蛋白載氧的時(shí)候，就由氧分子頂替水的位置。血紅素與它周圍的疏水性氨基酸殘基依靠范德華力保持確定的空間構(gòu)象。銅離子與血紅蛋白相互作用血紅蛋白在280nm附近有一個(gè)吸收峰，這是由于蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸共軛鍵的紫外
7、吸收所致，在400nm附近有一個(gè)索瑞(soret)吸收峰，這是血紅素卟啉環(huán)的π~π*躍遷帶，為強(qiáng)吸收峰。測試牛血紅蛋白醋酸緩沖液在加入銅離子醋酸緩沖液前后的紫外光譜發(fā)現(xiàn)，在血紅蛋白溶液中加入銅離子后，不論加入的銅離子濃度有多大，在280nm處的吸收峰均消失，而其400nm附近的強(qiáng)吸收峰則隨著銅離子濃度的增大降低越來越明顯(下圖左)，表明銅離子濃度越大，對(duì)蛋白質(zhì)π~π*躍遷帶的破壞性越大。左：2μmol/L血紅蛋白與不同濃度銅離子反應(yīng)分鐘后的紫外光譜圖右：血紅蛋白與銅離子相互作用時(shí)
