蛋白質(zhì)與核酸的定性與定量實(shí)驗(yàn)方法資料

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1、蛋白質(zhì)與核酸的定性與定量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)和掌握純化蛋白質(zhì)的原理和方法、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)量原理和方法。2、進(jìn)一步掌握使用雙縮脲法對(duì)蛋白質(zhì)的定性測(cè)定、利用定糖法對(duì)核酸的定性與定量測(cè)定二、實(shí)驗(yàn)原理1、蛋白質(zhì)的定性測(cè)定：雙縮脲法，課本P992、蛋白質(zhì)的定量測(cè)定：Folin-酚法，實(shí)驗(yàn)P193、核酸的定性與定量測(cè)定：定糖法，課本P131、4、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)量在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點(diǎn)的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽極移動(dòng)，直至某一pH位點(diǎn)時(shí)失去電荷而停止移動(dòng)，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的

2、等電點(diǎn)（pl）。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動(dòng)，直到它們的等電點(diǎn)上聚焦為止?？梢娫谠摲椒ㄖ?，等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過一定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶pH梯度的組成　　pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由于其不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負(fù)極間引入等電點(diǎn)彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物，在正極端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負(fù)極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質(zhì)的

3、混合物pH為一均值，即各段介質(zhì)中的pH相等，用pH0表示。電泳開始后，混合物中pH最低的分子，帶負(fù)電荷最多，pI1為其等電點(diǎn)，向正極移動(dòng)速度最快，當(dāng)移動(dòng)到正極附近的酸液界面時(shí)，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，這一分子不再向前移動(dòng)而停留在此區(qū)域內(nèi)。由于兩性電解質(zhì)具有一定的緩沖能力，使其周圍一定的區(qū)域內(nèi)介質(zhì)的pH保持在它的等電點(diǎn)范圍。pH稍高的第二種兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pI2，也移向正極，由于pI2＞pI1，因此定位于第一種兩性電解質(zhì)之后，這樣，經(jīng)過一定時(shí)間后，具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)按各自的等電點(diǎn)依次排列，形成了從正極到負(fù)極等電點(diǎn)遞增，由低到高的線性pH梯度。編輯本段兩性電解質(zhì)載體與

4、支持介質(zhì)　　理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個(gè)體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性?！　H梯度制作利用的兩性電解質(zhì)（ampholyte，商品名為ampholine），是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場(chǎng)作用下，自然形成pH梯度?！　∧z可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等1、蛋白質(zhì)的純化：凝膠層析，實(shí)驗(yàn)課本DEAE-Cellulose

5、離子交換：氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等大多是兩性物質(zhì)，在水溶液中帶有電荷，由于生物分子自身的性質(zhì)差異，造成了特定的介質(zhì)中所帶的點(diǎn)和種類和密度不同，這就是離子交換的理論依據(jù)。離子交換現(xiàn)象可用下面的方程式表示：Resin-SO3H+Na+H+Resin-SO3Na+H+=Resin-SO3H+Na+陰離子交換反應(yīng)：Resin-N(CH3)3OH+Cl-=n(ch3)3Cl-+OH-二乙基氨基纖維素DEAEhttp://wenku.baidu.com/view/9901378102d276a200292e37.html一、實(shí)驗(yàn)材料1、試劑(1)雙縮脲試劑實(shí)驗(yàn)P13(2)Folin-酚試劑，實(shí)驗(yàn)P19(

6、3)地衣酚試劑、二苯胺試劑(4)0.02mol/LNH4Ac、0.06mol/LNH4Ac流洗、0.3mol/LNH4Ac、1.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4Ac2、器材（1）紫外檢測(cè)儀、自動(dòng)部份收集器、記錄儀（2）Manifold聚焦盤、電極平臺(tái)、樣品杯二、實(shí)驗(yàn)方法1、雙縮脲區(qū)分蛋白質(zhì)與核酸2、蛋白質(zhì)純化1.平衡:0.02mol/LNH4Ac緩沖液平衡離子交換柱，紫外檢測(cè)儀、記錄儀基線穩(wěn)定;2.上樣:取下柱上端套塞，當(dāng)柱上液面與凝膠床面相切，立即將樣品小心而緩慢地加到柱床表面;3.洗滌:樣品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗滌柱壁1次;4.收集γ-球蛋白:將0.02m

7、ol/LNH4Ac緩沖液充滿層析柱，與高位恒壓槽連通，開啟自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集；5.洗滌其他球蛋白:記錄儀基線恢復(fù)到零后,用0.06mol/LNH4Ac流洗，不用進(jìn)行收集6.收集白蛋白:待記錄儀基線恢復(fù)到零后，用0.3mol/LNH4Ac緩沖液流洗，自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集;7.柱上再生:待記錄儀基線恢復(fù)到零后,用1.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4Ac流洗，不用進(jìn)行收集;8.再次平衡:待記錄儀基