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《雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)分光光度法測(cè)定的原理和方法2.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的原理和方法3.掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析1．原理2．主要方法：（1）比較吸收光譜曲線（2）比較最大吸收波長(zhǎng)蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為280nm，核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm。（3）比較吸光度的比值純DNA（二）利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析1．原理Beer-Lambert（比爾）定律：T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=KCL其中：T為透光率；A為吸光率；I0為入射光強(qiáng)度；I
2、為透射光強(qiáng)度；K為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為溶液光程的厚度2．常用方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測(cè)定條件必須一致。（2）標(biāo)準(zhǔn)管法CX/AX=CS/AS，已知CS，測(cè)定AS、AX，可求得CX。（3）摩爾吸光系數(shù)法C=A/?（?為L(zhǎng)=1cm，C為1mol/L時(shí)的吸光系數(shù)，也稱為摩爾吸光系數(shù)。四、分光光度計(jì)的使用1．722型分光光度計(jì)的外形2.儀器操作鍵介紹“方式設(shè)定”鍵（MODE）：用于設(shè)置測(cè)試方式“100%T/0ABS”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整零透射比“波長(zhǎng)設(shè)置”旋鈕：用于設(shè)
3、置分析波長(zhǎng)3.樣品測(cè)試操作①打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘②用“波長(zhǎng)設(shè)置”按鈕將波長(zhǎng)設(shè)置在您將要使用的分析波長(zhǎng)位置上③打開(kāi)樣品室蓋，將擋光體插入比色皿架，并將其推或拉入光路④蓋好樣品室蓋，按“0%T”鍵調(diào)透射比零⑤取出擋光體，蓋好樣品室蓋，按“100%T”調(diào)100%透射比⑥按“方式鍵”（MODE）將測(cè)試方式設(shè)置為吸光度方式(A)⑦將參比溶液和被測(cè)溶液分別倒入比色皿中⑧打開(kāi)樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋⑨將參比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”調(diào)零A⑩將被測(cè)溶液拉入光路中，此時(shí)，顯示器上所顯示是被測(cè)樣品的吸光度參數(shù)實(shí)驗(yàn)完
4、成后，關(guān)閉電源，洗凈比色皿，并蓋好蓋布。返回光路返回光路返回微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)總含量被測(cè)的天然含氮化合物與濃硫酸共熱時(shí)分解出氨，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨。在凱氏定氮儀中加入強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸汽蒸餾法將氨蒸入無(wú)機(jī)酸溶液中，然后再用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液進(jìn)行滴定，滴定所用無(wú)機(jī)酸的量(mol)相當(dāng)于被測(cè)樣品中氨的量(mol)，根據(jù)所測(cè)得的氨量即可計(jì)算樣品的含氮量。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)含氮量通常在16%左右，所以將凱氏定氮法測(cè)得的含氮量乘上系數(shù)6.25，便得到該樣品的蛋白質(zhì)含量。Folin-酚試劑法(Lowry法)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵(—C
5、O—NH—)，因此有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中，能與Cu2+形成絡(luò)合物。Folin酚反應(yīng)是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引進(jìn)Folin試劑(磷鉬酸—磷鎢酸試劑)，蛋白質(zhì)—銅絡(luò)合物能還原磷鉬酸—磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比例。本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、較紫外吸收法靈敏10—20倍，較雙縮脲法靈敏100倍。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長(zhǎng)處。在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值(OD28
6、0)與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測(cè)定。利用紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡(jiǎn)便、不消耗樣品，低濃度鹽類(lèi)不干擾測(cè)定?？偟鞍锥糠治觯瑽CA（Bicinchoninicacid，二辛可寧酸、二羧基二喹啉）?準(zhǔn)確靈敏：BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20－2000μg/ml；MicroBCA試劑測(cè)定范圍是0.5-20μg/ml?快速：45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便?經(jīng)濟(jì)實(shí)用：除試管外，測(cè)定可在微孔板中進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量?不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響?檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍(lán)基本原理：堿性條件下
7、，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度?？捡R斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度考馬斯亮藍(lán)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律，因此可以通過(guò)測(cè)定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。該法簡(jiǎn)單、迅速、干擾物質(zhì)少、靈敏度高（比Lowry法靈敏4倍）。CoomassieDye-Based蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3C
8、H3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+（二）雙縮脲法測(cè)
