胰腺組織總蛋白分步提取法的建立

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1、胰腺組織總蛋白分步提取法的建立【關(guān)鍵詞】總蛋白蛋白質(zhì)組基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜提取0引言近年來(lái),胰腺癌的發(fā)病率有逐年增多的趨勢(shì).手術(shù)切除率雖然有所提高,但5年生存率低于5%［1］.提高生存率的關(guān)鍵是早期診斷，但現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物敏感性和特異性均不理想.蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）的出現(xiàn)為尋找一種敏感性和特異性較高的腫瘤標(biāo)志物帶來(lái)了希望［2］.由于蛋白質(zhì)組研究相關(guān)技術(shù)體系建立時(shí)間較短,目前仍存在許多有待改進(jìn)之處,特別是在蛋白質(zhì)樣品制備方面.目前常用的組織總蛋白提取方法對(duì)于提取胰腺組織總蛋白存在一定缺陷，組織總蛋白質(zhì)一步提取法在完全溶解組織總蛋白(

2、特別是疏水蛋白質(zhì))以及蛋白的分離效果等方面存在缺陷.這些不足之處直接影響了蛋白質(zhì)組分析結(jié)果的全面性和準(zhǔn)確性.我們嘗試采用三步提取法［3］分步提取胰腺組織總蛋白,并和常規(guī)的一步提取法相對(duì)比，旨在建立提取胰腺組織總蛋白的標(biāo)準(zhǔn)方法.1材料和方法1.1材料健康雜種雄性犬1只，體質(zhì)量15.5kg（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）.尿素，硫脲，辛酰基硫代甘氨酸三甲內(nèi)鹽(SB310)，IPGbuffer(pH310)均購(gòu)自Sigma公司.蛋白酶抑制劑(cocktail)，胰酶抑制劑，3［(3膽酰胺丙基二乙胺］丙磺酸(3［(3Cholamidopropyl)d

3、imethylammonio］1propanesulfonate,CHAPS)，三氟乙酸(TFA)均購(gòu)自Solarbio公司.Trisbase,二硫蘇糖醇(DTT,北京鼎國(guó)公司)；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Beyotime公司）.VCX130PB超聲破碎儀(美國(guó)Sonics公司)，低溫超速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），Ultrospec1100Pro紫外分光光度計(jì)(瑞典Amersham公司)，MALDITOFMS質(zhì)譜儀（ABI公司）.1.2方法1.2.1標(biāo)本采集取狗的新鮮胰腺組織，1×磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗以去除血液和其他組織

4、.取同一部位的一塊組織留作實(shí)驗(yàn)用，其余組織立即放入液氮中速凍后轉(zhuǎn)存于-70℃冰箱.1.2.2總蛋白的一步提取取0．3g胰腺組織標(biāo)本用預(yù)冷的1×PBS液沖洗去除血液和其他組織，在冰面上用眼科剪剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm小塊并加入配置好的3mL裂解液：7mol／L尿素，2mol／L硫脲，5mL/LIPGbuffer(pH3～10)，65mmol／LDTT，40g/LCHAPS，5mg/L蛋白酶抑制劑，10mL/L胰酶抑制劑，混勻，在冰面上用超聲粉碎.4℃離心，120000g,30min，上清為蛋白提取物標(biāo)記為A，凍存于-70℃冰箱中.1.2.3總蛋

5、白的分步提取第一步，取0.3g胰腺組織用預(yù)冷的1×PBS液沖洗去除血液和其他組織，在冰面上用眼科剪剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm小塊并加入1mL裂解液I：40mmol／LTrisbase(pH8.1～8.3)，5mg/L蛋白酶抑制劑，10mL/L胰酶抑制劑，混勻，在冰面上用超聲粉碎.4℃離心，120000g,30min，取上清標(biāo)記為B1，凍存于-70℃冰箱中.第二步，在第一步沉淀離心管中加入1mL裂解液Ⅱ：8mol／L尿素，40mmol／LTris.5mL/LIPGbuffer(pH3～10)，65mmol／LDTT.40g/LCHAPS，5mg

6、/L蛋白酶抑制劑，10mL/L胰酶抑制劑.混勻，超聲粉碎、離心條件同前，取上清標(biāo)記為B2,凍存于-70℃冰箱中.第三步，用1mL裂解液Ⅲ：7mmol／L尿素，2mmol/L硫脲，20g/LSB310，20g/LCHAPS，5mL/LIPGbuffer，5mg/L蛋白酶抑制劑，10mL/L胰酶抑制劑，溶解第二步沉淀物.再行超聲粉碎，離心條件同前.取上清標(biāo)記為B3，凍存于-70℃冰箱中.1.2.4蛋白含量測(cè)定按照Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒的操作步驟操作.一步法和分步法所得到的總蛋白提取物分別測(cè)定總蛋白濃度，根據(jù)各自濃度計(jì)算出相應(yīng)的總蛋白含量.分步法中

7、將計(jì)算出的各步提取的蛋白含量相加即為其最終提取出的總蛋白量.1.2.5質(zhì)譜分析將樣品按1∶100稀釋，取1μL樣品和1μL基質(zhì)用渦旋混合器充分混和均勻，點(diǎn)在不銹鋼電樣板上，置于空氣中自然風(fēng)干.吸取1.5μL含1mL/LTFA的去離子水點(diǎn)到樣品上3～5s后，將溶液吸掉以去除樣品中的鹽分.儀器分析條件圖2分步法提取胰腺組織總蛋白基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜圖取物中識(shí)別出盡可能多的肽和蛋白混合物中的組分.而且還可以提供準(zhǔn)確的肽和蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和豐度.質(zhì)譜技術(shù)非常靈敏，一般只需10～15fmol蛋白就可得到滿意的結(jié)果，因此更有利于檢測(cè)出樣品中的低豐度蛋白，

8、而且具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性.胰腺組織中含有豐富的酶類，大約有70