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《高壓液相色譜hplc培訓教程（一）i.概論》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、高壓液相色譜HPLC培訓教程(一)I．概論一、液相色譜理論發(fā)展簡況???色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。???色譜法最早是由俄國植物學家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相
2、色譜法、液相色譜法。???液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromatography，HPL
3、C)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。二、HPLC的特點和優(yōu)點HPLC有以下特點：高壓-壓力可達150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。高速-流速為0.1~10.0ml/min。高效-可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度-紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：速度快-通常分析一個樣品在15~30min，有些樣品甚至在5mi
4、n內(nèi)即可完成。分辨率高-可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。靈敏度高-紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。柱子可反復使用-用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收-樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。三、色譜法分類???按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。
5、LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散系數(shù)大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。???按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法,此外還有電泳。按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。四、色譜分離原理???高效液相色譜法
6、按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。1．液固色譜法 ???使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。2．液液色譜法 ???使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分
7、離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。???涂布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。???液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。???正相色譜法 ???采用極性固定相(如
8、聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。???反相色譜法 ???一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、
