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1、口蹄疫疫苗制備工藝豬口蹄疫是由口蹄疫病毒（FootandMouthDiseaseVirus，F(xiàn)MDV）引起的豬等偶蹄動物多發(fā)的一種急性、熱性和傳播極為迅速的接觸性傳染病。該病早在14世紀的意大利學者第1次描述了FMDV。1898年，Loeffler和Frosch等證明了口蹄疫的病原體為濾過性病毒。本病廣泛分布于世界各地，目前除有少數(shù)國家已經(jīng)撲滅本病外，至今仍有70多個國家還時有發(fā)生。該病的發(fā)病率幾乎達100%，但病程一般呈良性經(jīng)過，死亡率只有2%～3%，仔豬呈惡性病型，死亡率可達50%～70%，該病除導致豬死亡造成直接經(jīng)濟損失外，最為嚴重的是由于其傳染性極強和引起大規(guī)模流行，并影響一個國
2、家的畜產(chǎn)品進出口貿(mào)易，造成巨大經(jīng)濟損失和政治影響，所以國際獸疫局將該病列為A類家畜傳染病之首，并列入世界范圍內(nèi)重要傳染病研究行列。口蹄疫病毒屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬。其最大顆粒直徑為23納米，最小顆粒直徑為7—8納米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七個主型cA、O、C、南非1、南非2、南非3和亞洲1型，以及65個以上亞型。O型口蹄疫為全世界流行最廣的一個血清型，我國流行的口蹄疫主要為O、A、C三型及ZB型(云南保山型)。據(jù)觀察，一個地區(qū)的牛群經(jīng)過有效的口蹄疫疫苗注射之后，1—2月內(nèi)又會流行，這往往懷疑是另一型或亞型病毒所致。這是因為該病毒易發(fā)生變異。該病毒對外界環(huán)境的抵抗力很強，在
3、冰凍情況下，血液及糞便中的病毒可存活120—170天。陽光直射下60分鐘即可殺死；加溫85℃15分鐘、煮沸3分鐘即可死亡。對酸堿之作用敏感，故1%一2%氫氧化鈉、30%熱草木灰、1%一2%甲醛等都是良好的消毒液。1．材料1．1主要設(shè)備生物反應器、細胞計數(shù)儀。1．2BHK21細胞懸浮適應株1．3口蹄疫種毒OJMS／2000株為現(xiàn)行?？谔阋唠p價疫苗制苗毒株，每0．2mL含有的LD50為107.0，亞洲I型為Asia1／JSL／GSZY／06株，每0．2mL含有的LD50為107.51．4培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基、病毒繁殖用細胞維持培養(yǎng)液、犢牛血清。1．5其他主要化學試劑消化液：EDTA-胰酶滅
4、活劑：二乙烯亞胺(BEI)阻斷劑：硫代硫酸鈉或焦亞硫酸鈉溶液油佐劑1．6試驗動物乳鼠2～4日齡吮小鼠，臨床健康。2.方法2．1細胞培養(yǎng)BHK21細胞系是制備FMD疫苗所需病毒抗原的理想細胞系。采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)培養(yǎng)BHK21細胞。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)是將種子細胞用消化液分散成單個細胞后加營養(yǎng)液震蕩,使細胞分散于營養(yǎng)液中,再將此營養(yǎng)液按一定比例分裝于若干圓柱形細胞瓶中,給細胞瓶加塞扎口后放置于轉(zhuǎn)瓶機上37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng),使營養(yǎng)液中的細胞附著于瓶壁,交替接觸營養(yǎng)液而分裂增值。傳統(tǒng)的消化液采用EDTA-胰酶。2.2病毒液制備選取培養(yǎng)2-3d、形態(tài)良好致密的單層BHK21細胞接入種毒,37攝氏度培養(yǎng)0.5h-2h使病
5、毒吸附于細胞后加入維持液繼續(xù)培養(yǎng),當細胞病變達90%(CPE)以上時,即可收取病毒液,病毒液經(jīng)菌檢及效檢合格后方可進入下一環(huán)節(jié)。實踐證明病毒液反復凍融使細胞破裂,充分釋放包含的病毒粒子,可提高病毒效價。轉(zhuǎn)瓶病毒培養(yǎng)屬勞動密集型方法,較難控制污染且容易散毒,但生產(chǎn)的病毒液效價比較高。懸浮培養(yǎng)法增值病毒是當反應器中懸浮培養(yǎng)的細胞數(shù)達到3×107/mL時接毒,約20-30h后收毒,病毒液的TCID50可達7-8。2.3病毒純化使用中空纖維超濾膜純化濃縮FMDV抗原,原液通過射流泵,在一定的壓力下呈湍流狀態(tài)在中空纖維超濾膜內(nèi)或外表分布流動,溶劑和小于截留分子量的物質(zhì)透過膜的俗稱透過液,而大于膜截
6、留分子量的膠質(zhì)等被截留的俗稱濃縮液,如要返回到原液中時,其原液的濃度會逐漸升高,此過程稱為“濃縮”,如此反復,從而實現(xiàn)大小分子量的分離,濃縮和提純的目的。2．4抗原滅活甲醛曾是FMDV疫苗生產(chǎn)中應用最為廣泛的滅活劑,但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),病毒液中的水解乳蛋白等物質(zhì)能抑制甲醛的滅活作用而導致滅活不徹底。上世紀80年代以來多數(shù)疫苗生產(chǎn)廠家改用乙烯亞胺類衍生物(aziridine)作為滅活劑,其中二乙烯亞胺(BEI)因毒性較小,現(xiàn)在被廣泛使用。2000年世界動物衛(wèi)生組織(OIE)向各國推薦使用1mmol/LBEI兩次滅活法,即20-37℃滅活24h后再加一次BEI滅活24h,經(jīng)多年應用效果較好。200
7、6年OIE又推薦了3mmol/LBEI兩次滅活法,BEI用量增加到3mmol/L,26℃分兩次共滅活48h,滅活劑用量加大使疫苗安全性更高,溫度降低有利于保持病毒粒子146S完整性。研究表明乙烯亞胺類衍生物與甲醛相比,不僅毒性大而且滅活后病毒穩(wěn)定性差,甲醛滅活的弗氏佐劑疫苗有效期可達10年,而BEI滅活的同類疫苗有效期僅2年左右。另有研究表明SAT2型FMDV經(jīng)乙烯亞胺類衍生物滅活后再經(jīng)甲醛處理,穩(wěn)定性明顯提高。甲醛與BEI協(xié)同作用
