冰片促進葛根素和梓醇口服吸收入腦的研究

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1、冰片促進葛根素和梓醇口服吸收入腦的研究［摘要］從細胞水平和動物水平考察冰片對葛根素和梓醇口服吸收及穿透血腦屏障入腦的影響，篩選適合梓葛復方口服制劑的冰片濃度。采用原代大鼠腦微血管內皮細胞和星型膠質細胞共培養(yǎng)建立體外血腦屏障模型，利用此模型研究62.5?100mg?L-1冰片對葛根素、梓醇轉運的影響。小鼠分別灌胃給予0，2.5，50，100mg-kg-1冰片溶液后再立即灌胃給予葛根素（200mg?kg-1）、梓醇（4.5mg?kg-1）納米晶混懸液，比較葛根素、梓醇在血漿和腦組織中的藥動學參數(shù)。腦微血管內皮細胞和星型膠質細胞共培養(yǎng)7d后，屏障功能基本形成。與未加入冰片組相比，冰片質量

2、濃度為1.2.5?100mg?L-1時，葛根素、梓醇跨血腦屏障模型的滲透系數(shù)顯著增大（P98%，四川玉鑫藥業(yè)有限公司，批號1.40602）；對羥基苯甲醛（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司，批號YY91.2.50）;梓醇（純度＞98%，石家莊流波白鳥生物科技有限公司，批號1.10808200508）;桃葉珊瑚苷（純度＞90%，潮州市澤潤制藥有限公司，批號20101.11.2）;熒光素納（純度＞99%，上海源葉生物科技有限公司，批號YY1.1.3.902.5g）；甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；其余試劑均為分析純；冰片購自和平藥房，經(jīng)齊紅藝教授鑒定，符合《中國藥典》要求。

3、雌雄KM小鼠，清潔級，購于重慶市中藥研究院實驗動物研究所，生產許可證號SCXD（渝）201.30006，實驗動物質量合格證號No0003.788。2方法2.1血腦屏障模型的建立2.1.1細胞共培養(yǎng)模型的建立腦微血管內皮細胞（BMECs）的培養(yǎng)與種植參照文獻［14］，從新生2周的乳鼠獲取原代腦微血管內皮細胞，于3.7°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取細胞融合度為80%?90%的BMECs，消化，收集細胞并調整密度至5X105個/mL，種植于細胞培養(yǎng)池內，1mL/孔。星型膠質細胞（AS）的培養(yǎng)與種植：參照文獻［14］，從新生3d左右的乳鼠獲取原代星型膠質細胞，于3.7°C、5%CO2培養(yǎng)

4、箱中培養(yǎng)。取細胞融合度為80%?90%的AS，消化，收集細胞并調整密度至5X105/mL,種植于Transwell池的背側，1mL/孔。2.1.2血腦屏障模型的鑒定2.1.2.1跨內皮細胞電阻值的測定將培養(yǎng)板取出，DHanks室溫平衡30min，測定跨內皮細胞電阻值TEEREc+filter,同時以無接種細胞的培養(yǎng)池作為對照，測定濾層的電阻值TEERfilter。單層內皮細胞的電阻值TEEREc二(TEEREc+filter-TEERfilter)XS(膜面積S=4.67cm2)。2.1.2.2熒光素納透過性分別測定質量濃度為004.32.4，04.3.24,4.3.2.4,4.3

5、.2.4,4.3.2.4mg?L-1的熒光素納對照品溶液在激發(fā)波長4.20nm和發(fā)射波長5.4.5nin處的熒光強度，繪制成熒光素鈉的熒光強度對濃度作標準曲線。在接受池中加入2mLDEMEF1.2液，在供體池中加入1mLDEMEF1.2液，于3.7°C預孵育30min后將供體池的DEMEF1.2換成1mL質量濃度為2.1.62mg?L-1熒光素納的DEMEF1.2液，分別于作用后的1.5，30，60，90，1.20min,從接受池中取出100uL滲透液，立即補充相同體積的空白DEMEF1.2液。測定滲透液中熒光素鈉的熒光強度，計算熒光素鈉的濃度。參考文獻［15］，按下式計算滲透系數(shù)

6、Papp=(dQ/dt)/(1/AXC0)。其中dQ/dt為熒光素鈉的轉運速度，A為Transwell池的擴散面積(A=4.67cm2)，CO為供體池中的初始濃度性的影響2.2冰片對BMECs和AS細胞活取融合度為80%?90%的細胞，按5X105個/cm2的密度接種于96孔板，分為空白對照組、正常對照組和試驗組共7個組?？瞻讓φ战M不加入細胞，正常對照組用等體積的DHanks液代替藥物，各實驗組加入葛根素(100mg*L-l)、梓醇(2.2.5mg?L-1)和冰片(質量濃度分別為1，10,50,100，200mg-L-l）的DHanks混合溶液100uLo藥物作用2.4h后，每孔加

7、入5g?L1的MTT液20uL,3.7°C孵育4h。終止培養(yǎng)，棄去上清液，加1.50uLDMSO，振搖混勻10min。測定4.90nm處的吸光度，按下試計算細胞存活率，選擇存活率大于90%的冰片進行后續(xù)試驗。細胞存活率=［（Asample-Ablank）/（Acontrol-Ablank）］X100%2.3冰片促進葛根素和梓醇跨BBB模型的轉運試驗在共培養(yǎng)的第7天，供體池和接收池分別加入1，2mLDHanks,平衡30min后吸去供體池中的液體，然后加入1mL葛根素、