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1、分子診斷技術的臨床應用佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院檢驗科曾釗宇狹義的分子診斷是基于核酸的診斷技術，是通過對DNA或RNA的檢測來實現對疾病的檢測和診斷。但是，隨著第一張人類基因組測序圖的完成，以及由此而帶來的基因組學、蛋白組學、代謝物組學等新興學科的發(fā)展，分子診斷的內涵已經從單純的DNA/RNA拷貝、突變等變化的檢測，拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測，并廣泛應用于疾病的篩查、診斷、治療監(jiān)測、預后與預防等生命科學的各個領域。一、分子診斷的概念根據分子診斷技術特征劃分為三類：一、基于分子雜交為基礎的分子診斷技術兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可
2、以在堿基互補的原則下形成異質雙鏈是遺傳物質最重要的化學特征，這一過程亦被稱為分子雜交。分子雜交是所有分子生物學技術的基礎，從最初的印跡雜交到聚合酶鏈反應（PCR），從基因芯片再到高通量的DNA測序技術，都離不開堿基互補的分子雜交反應。二、基于測序技術為基礎的分子診斷技術DNA的序列分析是分子診斷學的金標準，各種遺傳疾病，病毒或細菌的感染與變異，在基因表達水平上的個性化用藥，多基因疾病的診斷與預測，最終都可以借助基因測序平臺的應用。三、基于擴增技術為基礎的分子診斷技術1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應（Polymerasechainreaction，PCR），使體外擴增DN
3、A成為可能，開啟了體外擴增和操作DNA或RNA技術的發(fā)展。到現在，擴增DNA的技術已經成為分子診斷應用最廣的技術之一，并發(fā)展變化了數十種核酸擴增檢測技術。二、PCR概述（一）PCR概念PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項體外核酸擴增技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。PCR技術能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從
4、一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。二、PCR概述九十年代中期PCR臨床應用在國內全面展開1998年熒光定量PCR技術開始在中國應用于臨床檢測PCR發(fā)展簡史1983Mullis于12月16日成功發(fā)明了PCR1985關于PCR的文章首次由Mullis及其同事等人在《Science》雜志上發(fā)表198912月《Science》雜志將PCR和它所使用的TaqDNA聚合酶命名為第一個“年度分子”。199310月13日Mullis獲諾貝爾化學獎1995熒光定量PCR技術出現PCR技術PCR核心技術是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴增反應不需要
5、每一個循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實現了自動化，使應用領域迅速擴大，PCR技術成為了分子生物學中的一項突破性技術。PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇二、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性退火延伸（膜板）（雙鏈分成單鏈）（膜板與引物雜交）（DNA合成）不斷重復PCR循環(huán)次數與DNA產量關系高靈敏度高特異性簡便快捷高效擴增、忠實復制！PCR反應的特點三、熒光定量PCR技術的臨床應用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測性病相關病原體（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因檢測優(yōu)生優(yōu)育項目診斷：人巨細胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒（HSV
6、）、弓形蟲（TOX）、風疹病毒（RUB）其它病原體檢測：結核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等一病原體檢測常規(guī)結核病實驗室診斷方法及不足1.痰涂片作抗酸染色：陽性率低、費時2.細胞培養(yǎng)“金標準”：周期太長(4-8W)3.血清學診斷：a.接種BCG可出現陽性b.不能區(qū)分活動性結核病和治愈后留下損傷灶的病人c.交叉反應，假陽性不能早期診斷！容易漏診、誤診！熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義1.能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA，靈敏度高，特異性強2.早期、快速、準確地診斷結核病。痰液、肺及支氣管灌洗液——肺結核血液——播散性結核和各臟器的結核病腦脊液——中樞神
7、經系統(tǒng)結核病宮頸拭子、尿道拭子——泌尿生殖道結核病3.熒光定量PCR檢出結核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。4.TB-DNA濃度可用于判斷療效：痰標本中結核桿菌的數量呈逐漸下降趨勢，TB-DNA拷貝數下降。根據病原體DNA濃度，對藥物治療及療效觀察提供參考依據熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義二腫瘤相關基因表達的檢測：1、包括癌基因、抗癌基因2、腫瘤轉移基因3、轉移抑制基因三、熒光定量PCR技術的臨床應用三遺傳病1、等位基因檢測2、多基因遺傳病的突變檢測3、基因表達異常所
