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1、各生理指標的測定方法一、脯氨酸含量的測定1.茚三酮法1.1原理在正常環(huán)境條件下，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量較低，但在逆境（干旱、低溫、高溫、鹽漬等）及植物衰老時，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量可增加10-100倍，并且游離脯氨酸積累量與逆境程度、植物的抗逆性有關(guān)。用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標準曲線上查出（或用回歸方程計算）脯氨酸的含量。1
2、.2步驟試劑：（1）25%茚三酮：茚三酮------------0.625g冰乙酸------------15ml6mol/L磷酸--------10ml70°C水浴助溶；（2）6mol/L磷酸：85%磷酸稀釋至原體積的2.3倍；（3）3%磺基水楊酸：磺基水楊酸------3g加蒸餾水至------100ml實驗步驟：（1）稱取0.1g樣品放入研缽，加5ml3%磺基水楊酸研磨成勻漿，100°C沸水浴15min；（2）冰上冷卻，4000rpm離心10min；（3）提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚
3、三酮2ml混合均勻，100°C沸水浴30min，冰上冷卻；（4）加4ml甲苯混合均勻，震蕩30s，靜置30min；（5）以甲苯為空白對照，再520nm下測定吸光值。1.3計算方法脯氨酸含量（μg/gFW）＝X*提取液總量（ml）/樣品鮮重（g）*測定時提取液用量（ml）*10^6公式中：X-----從標準曲線中查得的脯氨酸含量（μg）提取液總量---------------------------5ml測定時提取液用量---------------------2ml問題及質(zhì)疑：1.酸性體系下，脯氨
4、酸與茚三酮加熱反應(yīng)后的最終產(chǎn)物為紅色，再實驗過程中，僅有少數(shù)時候能發(fā)現(xiàn)紅色產(chǎn)物。原因有待確定。2.經(jīng)查看文獻資料，反應(yīng)步驟已經(jīng)是優(yōu)化的，沒有問題。甲苯萃取脯氨酸與茚三酮的反應(yīng)產(chǎn)物，消除了多余未反應(yīng)的茚三酮，磺基水楊酸，提取液中其他雜質(zhì)（如色素）以及PH變化的干擾。3.根據(jù)茚三酮與脯氨酸的縮合反應(yīng)分析：（1）反應(yīng)體系的PH控制很重要，保持酸性環(huán)境，否則，反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸光值并不在520nm。（2）極限干旱材料或者重脫水材料的脯氨酸含量大，材料干重比新鮮材料多數(shù)倍，加相同量的茚三酮，反應(yīng)程度應(yīng)該有所不
5、同。而脯氨酸含量少的樣本，容易受到各種因素的干擾。二、丙二醛含量的測定1.原理植物在逆境下遭受傷害（或衰老）與活性氧積累誘發(fā)的膜脂過氧化作用密切相關(guān)，膜脂過氧化的產(chǎn)物有二烯軛合物、脂類過氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（MDA）是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，因此可通過測定MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。丙二醛在高溫及酸性環(huán)境下可與2-硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)產(chǎn)生紅棕色的產(chǎn)物3,5,5′-三甲基惡唑2,4-二酮（三甲川），該物質(zhì)在532nm處有一吸收高峰，并
6、且在660nm處有較小光吸收。由于醛、可溶性糖對此反應(yīng)有干擾，在450nm處有一吸收峰，用雙組分分光光度法加以排除。2.步驟試劑：（1）10%三氯乙酸（TCA）：TCA--------------25g加ddH2O至---------250ml（2）0.6%硫代巴比妥（TBA）：TBA------------0.6g加5%TCA至---------100ml實驗步驟：（1）稱取材料0.1g，加10%TCA2ml研磨至勻漿，再加8ml進一步研磨；（2）4000rpm離心10min，取上清至新管；（3
7、）2ml提取液+2ml0.6%TBA，混合均勻，2mlddH2O+2ml0.6%TBA為空白對照；（4）混合沸水浴15min，冰上冷卻；（5）4000rpm離心10min；（6）取上清再532nm，600nm，450nm波長下的光密度值。1.計算方法式中，Vt：提取液總體積（mL）----------------10ml；Vs：測定用提取液體積（ml）-------------2ml；FW：樣品鮮重（g）---------------------0.1g。注意事項：1．可溶性糖與TBA顯色反應(yīng)的產(chǎn)
8、物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），當植物處于極度干旱時可溶性糖含量會增高，必要時要排除可溶性糖的干擾。2．低濃度的鐵離子能增強MDA與TBA的顯色反應(yīng)，當植物組織中鐵離子濃度過低時應(yīng)補充Fe3+（最終濃度為0.5nmol·L-1）3．如待測液渾濁，可適當增加離心力及時間，最好使用低溫離心機離心。三、過氧化氫酶的活性測定——高錳酸鉀滴定法【原理】過氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑
