蛋白質(zhì)的分離與純化

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1、蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)分離純化的基本流程
選擇材料和預(yù)處理
細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離
蛋白質(zhì)的抽提
蛋白質(zhì)的純化
濃縮、干燥和保存一、材料的選擇和預(yù)處理微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮，注意選含量高、來(lái)源豐富及成本低的原料。對(duì)動(dòng)物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先除去結(jié)締組織和脂肪組織。對(duì)預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存，對(duì)于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。二、細(xì)胞的破碎（一）機(jī)械方法：主要通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破壞。
高速組織搗碎機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)1000

2、0rpm，具高速轉(zhuǎn)動(dòng)的鋒利的刀片），適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織的破碎。
玻璃勻漿器（用兩個(gè)磨砂面相互摩擦，將細(xì)胞磨碎），適用于少量材料；也可用不銹鋼或硬質(zhì)塑料等，兩面間隔只有十分之幾毫米，對(duì)細(xì)胞破碎程度比高速搗碎機(jī)高，機(jī)械切力對(duì)分子破壞較小。
小量的也可用乳缽與適當(dāng)?shù)木彌_劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細(xì)。（二）物理方法：主要通過(guò)各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎。
反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。
超聲波法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微

3、生物材料；只要有設(shè)備，該法方便且效果也好，但一次處理量較小。應(yīng)用超聲波處理時(shí)應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時(shí)宜慎重。（三）化學(xué)及生物化學(xué)法
有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等使細(xì)胞膜破壞；細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，采用溶菌酶處理效果更好。此外一些細(xì)胞膜較脆弱的細(xì)胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細(xì)胞脹破。細(xì)胞器的分離制備某一種生物大分子需要采用細(xì)胞中某一部分的材料，或者為了純化某一特定細(xì)胞器上的生物大分子，防止其他細(xì)胞組分的干擾，細(xì)胞破碎后常將細(xì)胞內(nèi)各組分先行分離，以便于獲得更好的分離效果。細(xì)胞器的分離一般采用

4、差速離心法細(xì)胞經(jīng)過(guò)破碎后，在適當(dāng)介質(zhì)中進(jìn)行差速離心。利用細(xì)胞各組分質(zhì)量大小不同，沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域，分離后即得所需組分。細(xì)胞器的分離制備，介質(zhì)的選擇現(xiàn)一般用蔗糖、Ficoll或葡萄糖-聚乙二醇等溶液。三、蛋白質(zhì)的提取提取是將經(jīng)過(guò)預(yù)處理或破碎了的細(xì)胞或組織置于一定條件下的溶劑中，讓被提取的蛋白質(zhì)以溶解狀態(tài)充分地釋放出來(lái)，并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不丟失生物活性的過(guò)程。大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類(lèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)。抽提所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、組成成分等條件的

5、選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑，使膜結(jié)構(gòu)破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過(guò)程中，應(yīng)注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。水溶液提取法
大部分蛋白質(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中，因此蛋白質(zhì)的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶度大，也是提取蛋白質(zhì)的最常用溶劑。
注意事項(xiàng)
溫度：一般采用低溫（4℃以下）操作
鹽濃度：等滲鹽溶液以0.02～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用；0.15mol/L氯化鈉溶液應(yīng)用也較多。
pH：提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH范圍有機(jī)

6、溶劑提取法
一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑提取；這些有機(jī)溶劑具有一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性，是理想的脂蛋白提取液。
必須在低溫下操作。
丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越
丁醇親脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)。
丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會(huì)引起酶的變性失活。
丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。表面活性劑的利用對(duì)于某些與脂質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)和酶，可以采用表面活性劑如膽酸鹽及十二烷基磺酸鈉等處理。表面活性劑有陰離子型（如脂

7、肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽(yáng)離子型（如氧化芐烷基二甲基銨等）及非離子型（TritonX-100、TirtonX-114、吐溫60及吐溫80）等。非離子型表面活性劑比離子型溫和，不易引起酶失活，使用較多。對(duì)提取物的保護(hù)無(wú)論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使生物大分子降解，導(dǎo)致天然產(chǎn)物的量減少。二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；碘乙酸可以抑制活性中心有巰基的蛋白水解酶的活性苯甲磺酰氟化物（PMSF）能清除蛋白水解酶活力還可通過(guò)選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使反應(yīng)條件適合于目