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《凝膠電泳技術(shù)2015》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、凝膠電泳技術(shù)吳乃虎(中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所)黃美娟(北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與遺傳學(xué)系)在電場的作用卜，不同的帶電荷分子或顆粒，通過凝膠介質(zhì)的遷移速度存在差異?。凝膠電泳便是根裾這一物理現(xiàn)象發(fā)展出來的一種分離、鑒定及純化核酸及蛋白質(zhì)人分了?的生化實驗技術(shù)。主要包括瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩人類。凝膠電泳在分子生物學(xué)及基因工程研究中具有策要的用途，已經(jīng)發(fā)展成為分析鑒定重組DNA分子、研究缶白質(zhì)與核酸相里作川的重要的實驗手段。同吋也是現(xiàn)在通川的許多分子生物寧研究方法，例如質(zhì)粒DNA分了?及限制什段的分離、鑒定與純化以及DNA分型、核
2、苻酸序列測定和DNA限制閣構(gòu)建等的技術(shù)難礎(chǔ)。一基本原理凝膠電泳的原理比較簡單。我們知道當(dāng)一種分子被放置在電場巾吋，它們就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。這種電泳分了在電場作用下的遷移速度，叫做電泳遷移率，它同電場的強(qiáng)度和電泳分子木身所攜帶的凈電荷成正比。也就是說，電場強(qiáng)度越人，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度也就越快，反之則較慢。山于在電泳中使用了一種無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠和丙稀酰胺凝膠等，從fW降低了對流運(yùn)動，故電泳的遷移率又是同分子的序爾系數(shù)成反比的。已知浮爾系數(shù)是分了的人小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，因此根據(jù)分了大小的
3、不同、構(gòu)型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分，按大小分部彼此分離開來。在生理條件K，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的。從這種意義上講，DNA和RNA的多核苷酸鏈可叫做多聚明離子(polyanioms)。因此，當(dāng)核酸分子被放置在電場當(dāng)屮時，它們就會A正電極的方A遷移。由十糖-磷酸卄架在結(jié)構(gòu)上的熏復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)景的雙鏈DNA兒乎具宥等景的凈電術(shù)，因此侖們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定屯場強(qiáng)度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，収決子核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子
4、量較小的DNA分了比分子g較大的DNA分子，具有較緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移卒也就比同等分子景的松散型的幵環(huán)DNA分子或線性DNA分子要快些。這就是應(yīng)川凝膠電泳技水分離DNA片段的基本原理。二凝膠的主要類型1.聚丙稀酰胺凝膠(polyacrylamidegel)系由閃稀酰胺(acrjylamide)單體同交聯(lián)化合物N，N'亞甲基雙閃稀酰胺(N，N-niethlenebisacrylamide)H^合劑存在的條並卜，交聯(lián)而成的?種具：?:維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝脫這種凝膠主要用于蛋白質(zhì)凝膠電泳和DNA序列測定中序列膠的制備。它分辨DNA分了雖人小的能力在1?l
5、OOObp之間(見表1)。(1)聚丙稀酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)系:?種應(yīng)甩聚通稀酰胺為支持介質(zhì)的高分辨率的區(qū)帶蟲途抆術(shù)，簡稱page,主要用于蛋白質(zhì)和小分子量的DNA片段的電泳分離。在此種凝膠電泳中，聚丙稀酰胺凝膠起到分子篩的作用，它的孔隙大小直接決定著分辨能力的人小。凝膠濃度越鬲其孔隙也就皞Z變得越小,分辨能力也就越強(qiáng);反之凝膠的濃g越低其孔隙也就變得越人，分辨能力也就隨之減弱。例如2%的聚內(nèi)稀酰胺凝膠電泳的分辨力，可高達(dá)l-6bpDNA片段；而3%的聚丙稀酰胺凝膠電泳的分辨力，則K降到lO
6、OObp左右的DNA大片段。表1凝膠電泳分辨DNA分子片段的能力凝膠的類型和濃度分離的DNA片段大小(bp)0.3%瓊脂糖凝膠50,000-1,0000.7%瓊脂糖凝膠20,000-1，0001.4%瓊脂糖凝膠6,000-2004%聚丙稀酰胺1,000-10010%聚丙稀酰胺500-2520%聚閃稀酰胺50-1(2)聚丙稀酰胺凝膠的優(yōu)點(diǎn)：第一，由于聚丙稀酰胺凝膠是一種具三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚合物，因此這就決定了它同其他電泳文持物的區(qū)別。即它具柯分子篩的作用，因此物質(zhì)在通過凝膠M狀結(jié)構(gòu)之空隙吋，要受到摩擦力(即肌力)的影響。所以人分子在泳動過程屮受到的阻力
7、耍比小分子的大。正是由丁凝膠;n有“分子篩”和“電泳”雙重作用，從而大大捉高了分辨力，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)或DNA什段混合物按分了大小精細(xì)地分離開來。具有分子篩和電泳雙功能作用。第二，凝膠的格了是帶冇酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物，沒冇或很少帶冇離了?的側(cè)某。因此，凝膠的電滲作用比較小，不容易和電泳樣品發(fā)生ffl互作用，而淀粉凝膠有時還帶有一些叨離子基，電泳吋會發(fā)牛.反向的電滲流動。穩(wěn)定性好，不易與電泳樣品發(fā)生相互作用。第三，山于聚丙稀酰胺凝膠是-?種人工合成的物質(zhì)，在聚合時調(diào)節(jié)單體的濃度比例,就可形成不同程度的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，K?空隙大小可以在較大范圍
8、Aj發(fā)生變化。
9、據(jù)此我們可以按照要分離的物質(zhì)之分子景人小，選擇適當(dāng)?shù)哪z濃度，使之既具有適當(dāng)?shù)目障?，乂具有較好的機(jī)械性能。分辨能力可根據(jù)實
