血清清蛋白鑒定

《血清清蛋白鑒定》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)報(bào)告2012-2013學(xué)年第一學(xué)期課程名稱：生物化學(xué)題目：牛血清清蛋白的鑒定院系：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院班級：2011級k-3班姓名：余國清學(xué)號：1120150305日期：2012-12-02實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^牛血清清蛋白的提取與鑒定，掌握鹽析、離心、透析、電泳、及呈色反應(yīng)的原理及應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)原理：應(yīng)用相同濃度硫酸銨反復(fù)鹽析法，將血清中的清蛋白與其他球蛋白分離，再利用透析法除鹽，即可提取清蛋白。再利用電泳技術(shù)，即可對牛血清清蛋白進(jìn)行分離與鑒定。實(shí)驗(yàn)步驟：1.鹽析取離心管一支加入牛血清待測液2ml、加入等量PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）稀釋血

2、清，搖勻后，逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液4ml，邊加邊搖，然后再2000r/min離心10min，將上清液倒入試管中，留供后面實(shí)驗(yàn)用。2.透析去玻璃紙（15cm*15cm）一張，折成袋形，將前面第一次鹽析得到的含清蛋白的上清液倒入袋內(nèi)，用線繩扎緊上口（注意要留有空隙），使透析袋下半部浸入盛有半杯蒸餾水中，對蛋白液進(jìn)行透析，并用玻璃棒攪拌袋外液體，以縮短透析時(shí)間。還應(yīng)經(jīng)常換水，并用納氏試劑檢查袋外液體的NH4+，觀察顏色變化，直至袋內(nèi)NH4+透析完畢。將袋內(nèi)液體倒入試管，既得牛血清清蛋白溶液。3.電泳①.點(diǎn)樣取一條2.5cm*8

3、cm膜條，將無光澤面向下，放入培養(yǎng)皿中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透，取出，用干凈濾紙吸去多余的緩沖液，以醋纖膜的無光澤面距一端1.5cm處作為點(diǎn)樣線，將牛血清樣品與待測的牛血清清蛋白溶液分別用點(diǎn)樣器在同一張薄膜的點(diǎn)樣線處不同位置點(diǎn)樣。②.電泳將點(diǎn)樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時(shí)無光澤面（即點(diǎn)樣面）向下，點(diǎn)樣端置于陰極，待平衡5min后，即可通電。用160伏電壓通電60分鐘，通電完畢后，用鑷子將膜條取出。③.染色將膜條直接浸于盛有氨基黑10B的染液中，染2min取出，立即浸于漂洗液中，分別在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背

4、景漂凈為止，用濾紙吸干薄膜。4.鑒定比較樣品與待測液中清蛋白在薄膜上的電泳結(jié)果，比較位置是否一致。預(yù)期結(jié)果：如果醋纖膜上的色帶位置一致，則說明提取的清蛋白得到了純化；若在待測液的電泳結(jié)果中出現(xiàn)其他球蛋白的色帶區(qū)域，則說明清蛋白的提取不夠純。實(shí)驗(yàn)儀器：名稱規(guī)格、型號數(shù)量說明普通離心機(jī)1離心血清電泳儀1檢驗(yàn)清蛋白離心管2裝鹽析血清液醋纖膜2.5cm*8cm1電泳玻璃紙15cm*15cm1透析清蛋白燒杯1透析試管2裝清蛋白滴管2加試劑玻璃棒1攪拌比色瓷盤2檢驗(yàn)NH4+天平1平衡離心管實(shí)驗(yàn)試劑：名稱規(guī)格、型號數(shù)量說明牛血清標(biāo)準(zhǔn)液2ml牛血

5、清待測液2mlPBS稀釋血清納氏試劑檢驗(yàn)NH4+氨基黑10B染色液染色巴比妥緩沖液浸透薄膜漂洗液Ⅰ漂洗漂洗液Ⅱ漂洗漂洗液Ⅲ漂洗硫酸銨pH7.2鹽析附表：PBS試劑：用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液。pH7.2飽和硫酸銨：用濃氨水將飽和硫酸銨溶液調(diào)到pH7.2。漂洗液：95%乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸餾水50ml。氨基黑10B染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml,冰醋酸10ml,蒸餾水40ml。巴比妥緩沖液：巴比妥鈉12.76g,巴比妥1.66g，用少量蒸餾水加熱溶解后，再加水稀釋至

6、1000ml。納氏試劑：溶解碘化鉀30g于蒸餾水20ml內(nèi)，再加入碘22.5g振搖使其溶解。于此碘液內(nèi)加入純汞30g，用力搖振之，待溫度升高時(shí)，將燒瓶浸于冷水內(nèi)，并繼續(xù)搖勻，直到暗棕碘色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S綠色為止。將上層溶液傾出，置于量筒內(nèi)，并以蒸餾水少許洗滌燒瓶，將洗滌液一并傾入。吸取此配成之溶液1到2滴，加入1%可溶性淀粉溶液1ml內(nèi)，以試驗(yàn)有無多余的碘存在，如不顯藍(lán)色（即無多余碘存在），可加入碘液（碘化鉀3g，碘2.5g溶于蒸餾水10ml內(nèi)配成）數(shù)滴于配成之溶液內(nèi)，直至此液加于淀粉溶液內(nèi)初顯藍(lán)色為止；將此液以蒸餾水稀釋至200ml，

7、加10%氫氧化鈉溶液975ml，混合，即成納氏試劑。試劑新配成呈現(xiàn)混濁，靜置數(shù)日，待其沉淀，再吸上清液供用。參考文獻(xiàn)：[1]陸紅玲.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程.西安：第四軍醫(yī)大出版社，2010[2]黃詒森,張光毅.生物化學(xué)與分子生物學(xué).第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008[3]錢士勻.臨床生物化學(xué)與分子生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006[4]郭堯君.蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù).第2版.北京：科學(xué)出版社,2005