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1、膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干細(xì)胞分離的實(shí)驗(yàn)研究何麟蔡洪劉誼陳忠鄒昆良鄧功建(四川達(dá)州市中心醫(yī)院635000)【中圖分類(lèi)號(hào)】R73-3【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1672-5085(2012)30-0072-03【摘要】目的研宄應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮法培養(yǎng)U-251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的方法;并分離該細(xì)胞系中的腦腫瘤干細(xì)胞，鑒定其特異性標(biāo)志物CD133+的表達(dá)并觀察其生長(zhǎng)和分化特征。方法應(yīng)用培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，在無(wú)血清培養(yǎng)基中釆用懸浮法培養(yǎng)人U-251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系；再將分離獲得的懸浮生長(zhǎng)的腦腫瘤干細(xì)胞利用免疫
2、熒光法檢測(cè)腦腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD133+在腦腫瘤干細(xì)胞球中的表達(dá)。再將腦腫瘤干細(xì)胞接種于含血清培養(yǎng)基，觀察其分化生長(zhǎng)和分化特征。結(jié)果U-251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中有約(2.56±0.2)%的腫瘤細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中能夠存活，增殖，形成自由漂浮的細(xì)胞球；其細(xì)胞表達(dá)CD133+神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物，并可連續(xù)傳代，若重新接種于含血清培養(yǎng)基中可重新貼壁分化，貼壁分化后細(xì)胞形態(tài)與直接在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的U-251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系無(wú)明顯差別。結(jié)論用懸浮無(wú)血清培養(yǎng)法從U-251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中成功培養(yǎng)出腦
3、腫瘤干細(xì)胞，其腫瘤干細(xì)胞能夠產(chǎn)生為多種細(xì)胞形態(tài)的分化細(xì)胞，腦腫瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng)成功對(duì)腦腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究具有重要價(jià)值【關(guān)鍵詞】U-251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系腦腫瘤干細(xì)胞懸浮法培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)基腦腫瘤居成人惡性腫瘤發(fā)病率前十位，其發(fā)病率和死亡率不斷升高，嚴(yán)重地威脅著人類(lèi)健康和生命。雖然外科手術(shù)和其他治療措施進(jìn)展很快，但仍很難治愈，經(jīng)手術(shù)(放療和化療治療后，病人幾乎無(wú)一例外地出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。在過(guò)去的20多年中，腦膠質(zhì)瘤的治療一直無(wú)明顯進(jìn)展［1］，最近研宄發(fā)現(xiàn)，腦腫瘤中存在著具有干細(xì)胞自我更新特性的細(xì)胞亞群即腦腫
4、瘤干細(xì)胞(braintumorstemcell,BTSC),是引發(fā)腫瘤并維持腦腫瘤的生長(zhǎng)的細(xì)胞來(lái)源(tumor-initiatingcell,TIC),在腫瘤的復(fù)發(fā)過(guò)程中起著決定性的作用［2］。腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells)是存在于腫瘤中含量較少的具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群體，它具有自我更新的能力，是形成不同分化程度的腫瘤細(xì)胞和腫瘤不斷擴(kuò)大的根源。腫瘤干細(xì)胞的消火就意味著消火了腫瘤。本實(shí)驗(yàn)中,我們使用成分相對(duì)簡(jiǎn)化成本較低的無(wú)血清培養(yǎng)基，應(yīng)用懸浮培養(yǎng)NSC(Neuralstemcells,NS
5、C)的實(shí)驗(yàn)方法，從U-251中成功分離培養(yǎng)出具有增殖形成BTS能力和分化能力的BTSC并連續(xù)傳代。這種懸浮培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便快捷，能奮效地分離和傳代BTSC,為BTSC的深入研究提供了材料。1材料和方法1.1材料U-251(人膠質(zhì)瘤細(xì)胞)：由跶明醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院免役治療中心提供,表皮生長(zhǎng)因子(購(gòu)買(mǎi)于PEPROTECHEC公司)，鹼性成纖維生長(zhǎng)因子(購(gòu)買(mǎi)于PEPROTECHEC公司)，DMEM/F12(購(gòu)買(mǎi)于GIBCO公司)，N2添加劑(購(gòu)買(mǎi)于GIBCO公司)，CD133一抗(購(gòu)買(mǎi)于SIGMA公司)，L-谷
6、氨酰胺(購(gòu)買(mǎi)于AMRESCO公司)，羊抗小鼠IG-FITC二抗(購(gòu)買(mǎi)于昆明W吉爾科技有限公司)。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)基俾統(tǒng)含血清培養(yǎng)基(serum-supplementedmedium,SSM)為含10.00%小牛血清的DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)基，并添加L-谷氨酰胺(2mmol/L胰島素(4u/L),青霉素G(l×105u/L),鏈霉素(100mg/L),無(wú)血清培養(yǎng)基(serum-freemedium,SFM),為不含胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基，并添加重組人
7、表皮生長(zhǎng)因子(epide-rmalgrowthfactor,EGF,PeproTech)、重.組人堿性成纖維生長(zhǎng)因(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF,PeproTech)、其它成分同上。1.2.2U-251中BTSC的分離培養(yǎng)與傳代先將U-251接種于傳統(tǒng)SSM中，在培養(yǎng)瓶中傳代。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用D-Hanks液清洗，胰酶(0.25%)消化，自制巴斯德吸管機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液，懸于SFM,臺(tái)盼蘭染色并計(jì)數(shù)，以l×106孔接種于6孔板，在37°C、5.
8、00%,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待BTSC增殖形成腫瘤干細(xì)胞球(braintumorsphere,BTS)3,4d后將其收集并機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液,重懸于SFM,按1:4的比例傳代于6孔板。U-251接種于傳統(tǒng)SSM中，連續(xù)傳代觀察作為對(duì)照。1.2.3有限稀釋、單克隆形成實(shí)驗(yàn)將貼壁生長(zhǎng)于SSM中的U-251細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，吹打成單細(xì)胞懸液，以每孔100μl無(wú)血清培養(yǎng)基中含10個(gè)細(xì)胞的濃度接種于96孔板，以后每日每孔添加20μl新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基,
