從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)方案

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1、土壤中產(chǎn)淀粉酶芽胞桿菌的篩選及其淀粉酶活力的測(cè)定設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)方案一、綜述：淀粉酶是淀粉降解酶。它們廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物體中。它們將淀粉及相關(guān)的聚合物分解為帶有具體淀粉分解酶特征的產(chǎn)品。淀粉酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中,是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類(lèi)繁多,特點(diǎn)各異,可應(yīng)用于造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑]等多種領(lǐng)域。在釀造發(fā)酵工業(yè)如酒精生產(chǎn)、啤酒制造、發(fā)酵原料液化及糖化工藝過(guò)程中均有重要價(jià)值,如添加淀粉酶分布非常廣泛，是人們經(jīng)常研究

2、的一種酶。從紡織工業(yè)到廢水處理，這些酶都有不同規(guī)模的應(yīng)用【1】。常見(jiàn)產(chǎn)淀粉酶的主要為芽孢桿菌屬。其中的常見(jiàn)產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌菌種有：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌【2】、凝結(jié)芽孢【3】。由于芽孢桿菌屬是一類(lèi)好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性?xún)?nèi)生抱子的桿狀細(xì)菌，許多為腐生菌，主要分布于土壤和植物體表面及水體中【4】。所以此次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?．了解生物分離提純的原理和方法技術(shù)2．掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測(cè)定的原理和方法4.培養(yǎng)學(xué)生的綜合應(yīng)用

3、微生物實(shí)驗(yàn)方法的能力5.培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程、綜合分析問(wèn)題解決問(wèn)題和判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力。三、實(shí)驗(yàn)原理自然界中，土壤是微生物生活最適宜的環(huán)境。土壤具有微生物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖和生命活動(dòng)中所需的各種條件。土壤中微生物的數(shù)量因土壤類(lèi)型、季節(jié)、土層深度與層次等不同而異。一般地說(shuō)，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表10cm～30cm的土層中菌數(shù)最多，隨土層加深，菌的數(shù)量減少【5】。從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微

4、生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。芽孢桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽(yáng)性；接觸酶陽(yáng)性；水解淀粉；VP試驗(yàn)陽(yáng)性；不產(chǎn)生吲哚；苯甲氨酸不脫氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不產(chǎn)生二羥丙酮；營(yíng)養(yǎng)體的最高生長(zhǎng)溫度大約從25℃到

5、75℃以上；最低生長(zhǎng)溫度大約5℃到45℃；生長(zhǎng)最低pH值，從7.5—8到2左右；耐鹽范圍從低于2%的NaCl到25%NaCl；營(yíng)養(yǎng)明膠（22℃）7天內(nèi)液化1厘米或1厘米以上?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌在糖發(fā)酵試驗(yàn)用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可產(chǎn)酸；作為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的最低限培養(yǎng)基是無(wú)維生素的，但含有葡萄糖、檸檬酸鹽和一個(gè)氨態(tài)鹽作為唯一的碳源和氮源【6】。細(xì)菌特性1.繁殖快速:代謝快、繁殖快，四小時(shí)增殖10萬(wàn)倍，標(biāo)準(zhǔn)菌四小時(shí)僅可繁殖6倍。2.生命力強(qiáng):無(wú)濕狀態(tài)可耐低溫-60℃、耐高溫+280℃，耐強(qiáng)酸、耐強(qiáng)堿、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧繁殖)、耐低

6、氧(厭氧繁殖)。3.體積大:體積比一般病源菌分子大四倍數(shù)，占據(jù)空間優(yōu)勢(shì)，抑制有害菌的生長(zhǎng)繁殖。四、實(shí)驗(yàn)材料和用具4.1土樣采集：采集廣大植物園內(nèi)的有機(jī)土壤，和生化樓下花壇的有機(jī)土壤4.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂(%)：蛋白胨1牛肉膏0.3氯化鈉0.5瓊脂1.5～2.0蒸餾水將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH至7.2～7.4。加入瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。4.3淀粉牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(%)：可溶性淀粉0.2牛肉0.3蛋白1.0氯化鈉0.5瓊脂1.5～2.0校正pH至7.2～7.44.4發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：玉米粉2黃豆餅

7、粉1.5CaCl0.02MgSO40.02NaCl0.25K2HPO40.2檸檬酸鈉0.2硫酸氨0.075(溶解后加)Na2HPO40.2校正pH值7.04.5葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（V.P試驗(yàn)用）（%）：葡萄糖0.5蛋白胨0.5K2HPO40.2校正pH7.2～7.44.6蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗(yàn)用）（%）：蛋白胨1%氯化鈉0.5%校正pH7.2～7.44.7西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基（%）：氯化鈉0.5硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.02磷酸二氫銨0.1磷酸氫二鉀0.1檸檬酸0.5瓊脂2溴麝香草酚藍(lán)溶液4酚紅試劑校正pH6.8先將鹽類(lèi)溶解于水中，

8、校正pH，再加入瓊脂，加熱融化，然后加入指示劑，混勻后分裝試管，121℃高溫滅菌15min。4.8配制營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基（%）：蛋白胨0.5、牛肉膏0.3、明膠1.2，