質(zhì)粒dna的提取與鑒定

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1、質(zhì)粒DNA的提取、定量酶切鑒定http://jpkc.fimmu.com/sfzx/南方醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中心ExpertimentalTeachingCenterofBiochemistryandMolecularBiology實驗內(nèi)容提取原理操作步驟計算方法操作步驟質(zhì)粒DNA定量酶切原理酶切步驟酶切電泳原理電泳步驟電泳2.質(zhì)粒DNA提取原理3.質(zhì)粒DNA操作步驟4.紫外檢測定量知識5.酶切原理、操作步驟6.瓊脂糖電泳原理及步驟7.凝膠成像系統(tǒng)質(zhì)粒DNA的提取酶切分析質(zhì)粒定量瓊脂糖凝膠電泳實驗流程實驗?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的方法了解

2、紫外吸收法檢測DNA濃度與純度的原理、方法學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳操作第二部分質(zhì)粒DNA提取與定量ExtractionandQuantitationofPlasmidDNA獨立于細菌染色替外，能獨立自主復(fù)制的閉合環(huán)狀DNA分子；存在于細菌，放線菌，真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多．質(zhì)粒（Ｐl(wèi)asmid）定義堿裂解法煮沸裂解羥基磷灰石柱層析法質(zhì)粒DNA釋放法酸酚法等方法選擇哪一種方法主要取決以下幾個因素：質(zhì)粒的大小大腸桿菌菌株裂解后用于純化的技術(shù)和實驗要求分離質(zhì)粒DNA的方法包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細菌；分離質(zhì)粒DNA分離質(zhì)

3、粒DNA三步曲分離質(zhì)粒收集裂解細菌質(zhì)粒擴增基本步驟基本原理1、堿裂解法基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異；高堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性；當以高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性并保存在溶液中，染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心形成沉定去除；2、離心層析柱基本原理硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA；去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細菌成分去除；低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫；☆原理示意圖（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、超凈工作臺、臺式離心機、高壓滅菌

4、鍋（二）材料：含pMD18-T質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α?（三）試劑：LB培養(yǎng)基（液體、固體）Bioteke質(zhì)粒提取試劑盒（北京百泰克，中國）溶液P1溶液P2溶液P3去蛋白液PE漂洗液WB洗脫液EB儀器材料50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)作用：分散細胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活注意：菌液一定懸浮均勻，不能有結(jié)塊溶液I0.2mol/LNaOH1%SDS作用：細胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。注意：時間勿太久，動作要溫柔，輕輕顛倒幾次溶液II5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸11.5m

5、l水28.5ml作用：酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS＋線性DNA沉淀，Na＋可中和DNA注意：復(fù)性時間不宜過長溶液III菌液離心13000rpm,1min棄上清瞬時離心徹底棄上清加250μl溶液P1旋渦振蕩懸浮沉淀加250μl溶液P2加400μl溶液P3顛倒數(shù)次放置3-5min離心13000rpm,10min取上700μl加到吸附柱中離心13000rpm,1min棄濾液，加入500μl去蛋白液13000rpm,1min離心（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）棄濾液，加入500μl漂洗液WB（10）離心13000rpm,1min

6、棄濾液，加入500μl漂洗液WB（11）離心13000rpm,1min棄濾液（12）空柱離心13000rpm,2min放入一個干凈的離心管中(開蓋放置3min)，在吸附膜的中間加60μl洗脫液EB(放置1min)離心13000rpm,1min（13）-20℃保存?zhèn)溆貌僮鞑襟E顛倒數(shù)次紫外光吸收法原理：1,物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應(yīng)2,而且物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的3,各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜因此不同波長的單色光通過溶液時其光的能量就會被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系.定量檢測計算方法:因為組成核酸的堿基

7、(G,A,T,C）在260nm處具有強吸收峰，所以通過測定260nm的吸收峰即可對DNA進行定量。dsDNA(雙鏈DNA)1A260=50ug/mlssDNA(單鏈DNA)1A260=33ug/mlRNA1A260=40ug/ml定量檢測記錄A260值，通過計算確定DNA濃度，公式如下:質(zhì)粒DNA(?g/ml)=50×(A260)×稀釋倍數(shù)注意:我們接下來要用的eppendorf公司生產(chǎn)的紫外分光光度計,會根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)自動算出質(zhì)粒DNA的最終濃度和Ratio值.定量檢測根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計核酸的純度（Ratio=A260/A

8、280）Ratio=1.8DNA樣品較純,符合實驗要求Ratio＞