膜片鉗實(shí)驗(yàn)與技術(shù)

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1、膜片鉗技術(shù)講座在《膜片鉗技術(shù)及應(yīng)用》（2003）一書(shū)的序言中寫(xiě)道：通常，一篇非常專業(yè)的科技論文公開(kāi)發(fā)表后，若被其他的論文引用數(shù)次，其作者就會(huì)感到欣慰；假如被別的作者引用十次以上，就可稱得上是一篇好論文；要是有幸被引用幾十上百次，甚至幾百次，那它無(wú)疑是一篇高質(zhì)量杰作，通常發(fā)表在權(quán)威的專業(yè)期刊或者是著名的科學(xué)雜志上，如“Nature”，“Science”，“Cell”和“Neuron”等。然而，你是否知道？有一篇論文，它的作者當(dāng)時(shí)還不太有名，刊登的雜志也不算頂級(jí)，可是論文發(fā)表20年來(lái)，已神話般地被世

2、界各地的科技工作者引用了一萬(wàn)二千余次，遍及生物醫(yī)學(xué)的眾多領(lǐng)域，而且近年來(lái)還在以平均每年約一千多篇的速度繼續(xù)被引用，它就是由Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人于1981年發(fā)表在《歐洲生理學(xué)雜志》上的著名論文。在此之前五年，身為德國(guó)科學(xué)家的Neher和Sakma

3、nn共同發(fā)明了膜片鉗技術(shù)（1976），并于15年后共同榮獲1991年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。目錄一、離子通道的概念二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)三、離子通道的分類四、離子通道的研究技術(shù)五、膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法六、膜片鉗改良模式及其它研究方法一、離子通道的概念離子通道（ionchannels）是鑲嵌在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層上的一種特殊整合蛋白，在特定情況下，形成具有高度選擇性的親水性孔道，允許適當(dāng)大小和電荷的離子以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式通過(guò)。離子通道具有兩大共同特征，即離子選擇性及門(mén)控特性。選擇性包括通道對(duì)離子大小的選擇性及

4、電荷選擇性，如安靜時(shí)神經(jīng)細(xì)胞膜離子通道對(duì)K+的通透性比Na+大100倍，而神經(jīng)興奮時(shí)，對(duì)Na+通透性又比K+大10~20倍。通道閘門(mén)的開(kāi)啟和關(guān)閉過(guò)程稱為門(mén)控（gating）。通道可表現(xiàn)為三種狀態(tài)，即備用、激活及失活狀態(tài)。二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)隨著生物物理學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，新的研究技術(shù)的應(yīng)用，特別是膜片鉗片技術(shù)與分子克隆、基因突變和異體表達(dá)等技術(shù)的結(jié)合，使離子通道的研究迅速進(jìn)入到分子、亞分子水平，人們已開(kāi)始有能力從分子水平來(lái)確定通道的分子結(jié)構(gòu)和解釋離子通道的孔道特性。１．電壓門(mén)控離子通道的

5、基本結(jié)構(gòu)經(jīng)純化、克隆和測(cè)定表明，離子通道蛋白是由多個(gè)亞基構(gòu)成的復(fù)合體。電壓門(mén)控離子通道由α、β、γ、δ等亞基構(gòu)成，但不同的離子通道的組成略有差異，如鈉通道由α、β1、β2和β3、β4亞基組成，鈣通道由α1、α2、β、γ和δ亞基組成，鉀通道由α和β亞基組成等。在各亞基中，α亞基是構(gòu)成離子通道的主要功能單位，而其它亞基則只起調(diào)節(jié)作用。α亞基是一條跨膜多肽，由1800~2000個(gè)氨基酸組成。它包括四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（Ⅰ~Ⅳ），每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有6個(gè)α螺旋片段（S1~S6）,除S4為親水性跨膜螺旋片段外，其余5

6、個(gè)均為疏水性跨膜螺旋片段。位于S5和S6間的一段氨基酸序列部分貫穿膜內(nèi)，是形成親水性孔道而使離子選擇性通過(guò)的部分稱為孔道區(qū)（poreregion）或P區(qū)，四個(gè)結(jié)構(gòu)域圍繞一個(gè)中心對(duì)稱排列，P區(qū)在內(nèi)組成孔道內(nèi)壁。S4肽段含有一些帶正電荷的氨基酸殘基（如精、賴氨酸），對(duì)膜電位的變化敏感，起電壓感受器的作用。當(dāng)膜去極化時(shí)，每一個(gè)功能區(qū)的S4肽段做螺旋運(yùn)動(dòng)而使正電荷移出產(chǎn)生微弱而短暫的門(mén)控電流，導(dǎo)致通道構(gòu)象變化。當(dāng)四個(gè)結(jié)構(gòu)域S4肽段均發(fā)生這種構(gòu)象變化時(shí)，則通道便處于激活開(kāi)放狀態(tài)，因此，S4肽段又稱為激活閘

7、門(mén)（activationgate,m閘門(mén)）在通道開(kāi)放后，很快Ⅲ結(jié)構(gòu)域的S6與Ⅳ功能區(qū)的S1之間的肽鏈構(gòu)成失活閘門(mén)（inactivationgate,h閘門(mén)），形成一“活瓣”，將通道內(nèi)口阻塞，調(diào)控通道的失活過(guò)程。２．化學(xué)門(mén)控離子通道的基本結(jié)構(gòu)當(dāng)各種化學(xué)物質(zhì)與化學(xué)門(mén)控離子通道相應(yīng)部位結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致通道蛋白發(fā)生構(gòu)型變化，引起通道開(kāi)放，產(chǎn)生離子電流。體內(nèi)這種離子通道的種類很多，主要包括各種神經(jīng)遞質(zhì)門(mén)控離子通道、ATP敏感鉀通道和鈣依賴性鉀通道等。神經(jīng)遞質(zhì)門(mén)控離子通道又稱為離子通道受體，主要有乙酰膽堿門(mén)控

8、離子通道、GABA門(mén)控離子通道及谷氨酸門(mén)控離了通道三大類。乙酰膽堿門(mén)控離子通道由α1γα2βδ五個(gè)亞基組成，呈五邊形排列。每個(gè)亞基有4個(gè)跨膜區(qū)段即M1~4，由五個(gè)亞基的M2共同構(gòu)成孔道的內(nèi)壁。在α1和α2亞基N端的細(xì)胞外部分各有一個(gè)ACh結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)ACh分子與α亞基結(jié)合后，便引起通道蛋白的構(gòu)象變化和通道開(kāi)放，主要引起Na+內(nèi)流增多。三、離子通道的分類非門(mén)控離子通道門(mén)控離子通道電壓門(mén)控性通道化學(xué)門(mén)控性通道機(jī)械門(mén)控性通道1、非門(mén)控性離子通道有些離子通道始終處于開(kāi)放狀態(tài)，離子可隨時(shí)進(jìn)出細(xì)胞，并不